葉莉莎, 韓 園, 劉啟星, 張占琴, 梅虹霞, 曹 紅, 連慶泉, 李 軍

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，浙江 溫州 325027)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)又稱老年性癡呆，是以進(jìn)行性癡呆為主要臨床表現(xiàn)的大腦變性疾病。海馬和學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，AD發(fā)病時海馬往往最先受累。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)作為一應(yīng)激活化蛋白激酶，各種胞外刺激后其在AD的腦內(nèi)表達(dá)增強。高遷移率族框蛋白1(high mobility group box protien 1，HMGBl)是一種核因子和DNA結(jié)合蛋白，在炎癥和非炎癥性刺激時便大量合成和釋放到胞外，加速腦疾病的進(jìn)程[1-2]。已發(fā)現(xiàn)AD患者腦內(nèi)HMGB1表達(dá)升高，可加重認(rèn)知功能障礙及記憶力減退[3]。姜黃素作為一種多元酚，具有抗氧化、抗炎和親脂活性，已被用于AD和其它慢性疾病的治療。本實驗旨在探討姜黃素對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、海馬HMGB1、JNK表達(dá)的影響，為姜黃素的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1動物與分組 清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，體重250～270 g，由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。實驗動物于實驗開始前1周，飼養(yǎng)于晝夜節(jié)律 12/12 h(8Am～8Pm)通風(fēng)良好的動物房，室溫控制在(22±2)℃，相對濕度50%～70%。采用隨機數(shù)字表法將其隨機分為空白對照組(A組)、模型組(B組)、姜黃素治療組(C組)和玉米油溶劑對照組(D組)，每組9只。

1.2試劑和儀器 鵝膏蕈氨酸(ibotenic acid,IBO)、姜黃素和玉米油(Sigma)；兔抗SAPK/JNK單克隆抗體(Cell Signaling Technology)；兔抗HMGB1 單克隆抗體(Abcam)；兔抗GAPDH抗體和兔超敏二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。大鼠標(biāo)準(zhǔn)型腦立體定位儀(深圳瑞沃德公司)，Morris 水迷宮分析系統(tǒng)(北京碩林苑科技公司)。

2 方法

2.1AD模型制備及分組處理 大鼠腹腔注射5%水合氯醛7 mL/kg麻醉，頭部依靠兩耳桿和切牙鉤3點固定，根據(jù)大腦立體定位圖譜，計算出基底核前后向(AP)、左右側(cè)(L)、垂直軸(V)3個方向的坐標(biāo)(前囟后1.0 mm、中線旁2.6 mm、硬脊膜下7.8 mm)[4]。用2 mL注射器的針頭在靶點上鉆孔，微量注射器對準(zhǔn)靶點，緩慢進(jìn)針至顱骨下7.8 mm處注入IBO 8 μg，注射時間持續(xù)5 min并留針5 min，緩慢退針。術(shù)后縫合皮膚并肌注青霉素2×105U預(yù)防感染，置于保溫毯至清醒。造模24 h后，A組和B組大鼠不給予任何藥物，C組大鼠連續(xù)腹腔注射100 mg/kg 姜黃素6 d，D組大鼠連續(xù)腹腔注射4 mL/kg玉米油6 d。各組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)。

2.2行為學(xué)測試 術(shù)后第7天開始為期7 d的Morris水迷宮定位航行實驗。實驗第1天讓大鼠熟悉水迷宮環(huán)境，將其放入撤除平臺的池中游泳60 s。從第2天進(jìn)行正式實驗，以4個象限輪流作為入水點，將大鼠頭部背向平臺貼壁入水，記錄找到平臺的時間，即逃避潛伏期，設(shè)定120 s為最長逃避潛伏期。如果大鼠首次未搜索到平臺，將其引至平臺上停留30 s，引導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶，這時潛伏期記為120 s，之后開始下一象限實驗。若首次找到平臺，亦放置30 s。記錄4次潛伏期的均數(shù)即平均逃避潛伏期(average escape latency，AEL)進(jìn)行統(tǒng)計分析以判斷大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

2.3免疫組化檢測 行為學(xué)實驗測試結(jié)束后，開胸經(jīng)左心室插管至主動脈，分別灌注4 ℃生理鹽水和4%多聚甲醛各200 mL。斷頭取海馬并固定于4%多聚甲醛中，石蠟包埋。切片，片厚4 μm。切片置二甲苯、乙醇梯度脫蠟， PBS 沖洗2次，每次3 min，0.01 mol /L 枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0) 中高壓修復(fù)，自然冷卻至室溫，PBS 沖洗2次，每次3 min；3% H2O2室溫10 min；兔抗HMGB1抗體(1∶750)4 ℃孵育過夜，加聚合物增強劑，室溫孵育20 min；加酶標(biāo)抗兔聚合物，室溫孵育20 min； DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，封片。取每只大鼠海馬區(qū)腦切片6張(部位相同)，觀察光鏡(×400)下海馬組織 CA1、CA3 區(qū)圖像，利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對CA1和 CA3 區(qū)HMGB1行半定量分析，計算每組36張切片上HMGB1的積分吸光度值(integrated value,IA)。

2.4Western blotting檢測 取新鮮海馬組織，-70 ℃保存。行免疫印跡檢測時，從低溫冰箱中取出海馬組織。按15 μL上樣總體積30 μg蛋白配置，加上樣緩沖液后變性。上樣后，樣品在濃縮膠內(nèi)的電壓為60 V、分離膠為100 V進(jìn)行電泳，溴酚藍(lán)接近凝膠底部時停止電泳。300 mA電流濕轉(zhuǎn)1 h。5%脫脂奶粉常溫封閉1.5 h。兔抗HMGB1抗體稀釋度為1∶10 000，兔抗SAPK/JNK抗體稀釋度為1∶1 000，兔抗GAPDH抗體稀釋度為1∶2 000，將目的蛋白放置在相應(yīng)的抗體中4 ℃過夜。辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔II抗(HMGB1對應(yīng)的II抗稀釋為1∶2 000，JNK和GAPDH對應(yīng)的II抗稀釋為1∶10 000)室溫孵育1 h。ECL顯影，采用AlphaEase FC凝膠圖像分析軟件進(jìn)行曝光和半定量分析，將目的蛋白/GAPDH的灰度值作為目的蛋白表達(dá)的相對強度。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，水迷宮潛伏期數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析，免疫組化和Western blotting數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗，多組樣本均數(shù)比較行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，方差齊者采用LSD法，方差不齊者采用Tamhane’s T2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 行為學(xué)測試

定位航行實驗中，與A組大鼠相比，B和D組大鼠各時點AEL明顯延長(P<0.05)，C組大鼠第5天和第6天 AEL明顯短于B組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮實驗AEL的比較

2 免疫組化

A、C組大鼠海馬CA1區(qū)及CA3區(qū)HMGB1陽性細(xì)胞較少，B、D組HMGB1陽性表達(dá)增多，且大多數(shù)位于胞漿及胞外。IA比較發(fā)現(xiàn)，B組和D組CA1區(qū)及CA3區(qū)HMGB1釋放量明顯多于A組(P<0.05)，而2組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；C組CA1區(qū)及CA3區(qū)HMGB1釋放量與A組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但均明顯低于B組和D組(P<0.05)，見圖1、2和表2。

Figure 1. Expression of HMGB1 in hippocampal CA1 region in each group(immunohistochemical staining, ×400).A: blank control group; B: model group; C: curcumin treatment group; D: solvent control group.

Figure 2. Expression of HMGB1 in hippocampal CA3 region in each group(immunohistochemical staining, ×400).A: blank control group; B: model group; C: curcumin treatment group; D: solvent control group.

表2 4組大鼠海馬各區(qū)HMGB1積分吸光度的比較

3 Western blotting

4組大鼠海馬HMGB1表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但B組和D組JNK表達(dá)水平明顯高于A組，C組JNK表達(dá)水平與A組相近，均明顯低于B組和D組(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. Expression of HMGB1 and JNK proteins in each group.A: blank control group; B: model group; C: curcumin treatment group; D: solvent control group. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs group A；#P<0.05 vs group B.

討 論

AD主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙和記憶損害，因此實驗中均以記憶功能下降作為AD動物模型建立的標(biāo)準(zhǔn)，以記憶能力改善作為判斷藥物有效性的條件之一?；浊澳X膽堿能神經(jīng)元、海馬和大腦皮質(zhì)為膽堿酯酶傳遞和學(xué)習(xí)記憶能力的主要位點，將興奮性氨基酸IBO注入 Meynert基底核，通過谷氨酸受體特異激動膽堿能神經(jīng)元引起神經(jīng)元損傷，信號通路隨之調(diào)節(jié)異常，學(xué)習(xí)記憶狀況變差[5]。

流行病學(xué)調(diào)查顯示印度AD患者較美國低4～5倍[6]，推測原因與印度人常食用含有姜黃素成分的物質(zhì)(如咖喱)有關(guān)。研究表明，姜黃素對炎癥相關(guān)性神經(jīng)退行性疾病具有保護作用[7]。本實驗采用腹腔注射姜黃素對AD大鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，但其防治AD的機制尚不清楚。本研究之所以選擇Morris 水迷宮測試作為行為學(xué)檢測的方法是因為研究發(fā)現(xiàn)它比其它設(shè)備(T迷宮、八臂迷宮等)的設(shè)計更為合理[8]。

HMGB1是一種核因子和DNA結(jié)合蛋白，當(dāng)體內(nèi)內(nèi)環(huán)境處于穩(wěn)態(tài)的狀態(tài)下，以不同的水平存在于大多數(shù)細(xì)胞核，腦內(nèi)主要集中于大腦皮質(zhì)、海馬、尾狀核等處，表達(dá)于神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，起到穩(wěn)定核小體、參與DNA重組和修復(fù)、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞分化等作用[9-10]，但當(dāng)炎癥和非炎癥刺激時，HMGB1便大量合成和釋放到胞外，作為一重要的晚期炎癥因子而加速疾病的進(jìn)程[3]。HMGB1 可維持和延長炎癥, 還是決定細(xì)胞選擇凋亡或壞死的一個關(guān)鍵信號[11]。盡管目前機制尚不是十分明確，但衰老絕對是包括AD在內(nèi)的許多神經(jīng)退行性病變的風(fēng)險因素。近來發(fā)現(xiàn)HMGB1在AD發(fā)病中起到了促進(jìn)作用，隨著年齡增加，HMGB1在大腦不同區(qū)域的表達(dá)水平有所改變，神經(jīng)元中 HMGB1的胞外釋放增加，且此時神經(jīng)元中 DNA雙鏈斷裂明顯增加[12]。本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能抑制全腦缺血再灌注大鼠海馬HMGB1的合成與釋放，減輕再灌注損傷而起到腦保護作用[13]。本研究試圖進(jìn)一步探索姜黃素能否通過抑制 HMGB1的表達(dá)而對 AD起到有益作用，評估 HMGB1在 IBO誘導(dǎo)AD大鼠中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AD模型組大鼠 CA1和 CA3區(qū)海馬神經(jīng)元錐體細(xì)胞大量減少，大量 HMGB1釋放到胞漿及胞外，而 姜黃素C組大鼠胞漿、胞外釋放減少，證實姜黃素可以抑制HMGB1胞漿、胞外釋放的作用。

JNK為保守的蘇氨酸、絲氨酸蛋白激酶，作為重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子參與細(xì)胞的適應(yīng)、增殖和老化；JNK 通路的激活可增加大鼠腦缺血再灌注后海馬神經(jīng)元caspase-3 的表達(dá)，促進(jìn)海馬神經(jīng)元凋亡[14]。若抑制JNK的表達(dá)，可減少凋亡發(fā)生，改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[15]。本實驗 A和 C組大鼠海馬 JNK表達(dá)減少，AEL縮短，學(xué)習(xí)記憶能力增強；而B和D組大鼠JNK表達(dá)增高，AEL則明顯延長，學(xué)習(xí)記憶能力能力得到毀損。 姜黃素可抑制JNK的表達(dá)，說明AD的發(fā)病可能和JNK通路有關(guān)。姜黃素能夠減少 HMGB1的胞漿、胞外釋放，然而海馬區(qū) HMGB1的蛋白含量檢測并未明顯變化，提示AD大鼠大腦損傷主要和胞漿、胞外釋放的 HMGB1有關(guān)。

總之，姜黃素能夠改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機制可能與抑制HMGB1的胞漿、胞外釋放及JNK的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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