向鏡芬， 楊 祥， 龔劍鋒， 雷偉健， 鄧艷瓊， 牟 丹， 鐘國權(quán)， 孟啟勇

(暨南大學(xué)第五附屬醫(yī)院，清遠市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科， 廣東 清遠 511500)

膿毒癥是由感染引發(fā)的全身性炎癥反應(yīng)綜合征，是ICU患者發(fā)生急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)的常見原因[1]。AKI是預(yù)測膿毒癥患者死亡的獨立危險因素[2]。尋找介導(dǎo)膿毒癥AKI腎小管上皮細胞損傷的關(guān)鍵分子并闡明其調(diào)控機制，對于早期干預(yù)膿毒癥AKI具有重要的科學(xué)意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)細菌內(nèi)毒素及其炎癥因子是誘導(dǎo)腎臟損傷的直接且重要的原因。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激機體引發(fā)嚴重炎癥反應(yīng)，常常產(chǎn)生大量致炎癥因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激、線粒體損傷和能量耗竭，最終導(dǎo)致腎小管上皮細胞凋亡[3]。在此過程中，細胞自噬對于腎小管上皮損傷和修復(fù)可能發(fā)揮了重要的作用。

自噬是真核細胞處于缺氧、饑餓或感染時，在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下，利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質(zhì)，為細胞修復(fù)、更新提供原料與營養(yǎng)、保持能量穩(wěn)態(tài)的過程，是有別于凋亡的另一種程序性死亡機制[4]，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)通路是影響細胞自噬重要的信號通路[5]。近年來有研究表明，自噬在膿毒癥的致病過程中發(fā)揮重要作用[6-8]。那么自噬是否參與了膿毒癥時腎小管上皮細胞的損傷機制？PI3K/beclin-1復(fù)合物的形成對膿毒血癥時腎小管上皮細胞的自噬是否至關(guān)重要？值得深入研究。本研究擬建立盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)模擬腹膜炎大鼠膿毒癥模型，觀察腎小管上皮細胞是否存在自噬現(xiàn)象。并且進一步進行體外實驗證實是否一定濃度的LPS可刺激腎小管上皮細胞發(fā)生自噬，探討PI3K/Akt信號通路是否通過形成復(fù)合物促進自噬對膿毒癥時腎小管上皮細胞的保護作用，為臨床干預(yù)膿毒癥AKI提供新的策略。

材 料 和 方 法

1 材料

雄性SD大鼠，250～300 g，9只購自中山大學(xué)動物中心。HK-2細胞株購自ATCC。BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自Pierce。微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)抗體購自Sigma。p-Akt(308)抗體、p-Akt(472)抗體、Akt抗體、beclin-1抗體、GAPDH抗體和活化caspase-3 抗體均購自CST。多聚賴氨酸購自Sigma。DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購于Gibco。二甲基亞砜購自Sigma。山羊抗兔Ⅱ抗為Jackson產(chǎn)品。其它所用生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1膿毒癥誘發(fā)急性腎損傷模型的構(gòu)建 SD大鼠麻醉用 10%水合氯醛(生理鹽水配制)腹腔注射，劑量為4 mL/kg。在腹部中線打開腹腔(切口3～4 cm)，找到盲腸，仔細將盲腸間的腸系膜剪開(注意不要剪斷膜上的血管，以避免大出血)，在離盲腸4 cm處用5-0絲線結(jié)扎，18G針頭(10 mL注射器針頭)穿刺4次，在穿孔處輕輕擠出1 mm排泄物。6-0絲線兩層縫合傷口。腹腔注射(50 mL/kg皮下注射)預(yù)熱生理鹽水，籠中蘇醒。CLP 6 h后皮下注射廣譜抗生素(亞胺培南/西司他丁)14 mg/kg(10 mL預(yù)熱生理鹽水)。麻醉動物后6 h和24 h，采血、處死并摘取腎臟。

2.2腎損傷指標(biāo)檢測

2.2.1組織切片糖原染色 各組處死后取右側(cè)腎臟一部分，將剩余部分的腎皮質(zhì)置于液氮中凍存后轉(zhuǎn)至-70 ℃ 存放, 用于Western blotting檢測蛋白的表達。將腎臟置于甲醛溶液固定48 h，放入自動脫水機中進行固定，共設(shè)定 12 h，固定后再進行石蠟包埋，包埋后在切片機上進行切片，后將切片放入防脫載玻片上，置于4 ℃冰箱保存。PAS染色步驟如下：常規(guī)切片 2～3 μm，脫蠟至水，0.5%高碘酸氧化 6～8 min，蒸餾水洗，無色品紅加蓋避光7 min，不經(jīng)水洗，擦凈組織旁多余染液，0.5%偏重亞硫酸鈉作用 1 min，水洗 2～5 min，Harris 蘇木素復(fù)染 1 min 左右，水洗，1%鹽酸乙醇分化。片刻，自來水反復(fù)沖洗，溫水反藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察腎間質(zhì)及腎小管的變化并拍照。

2.2.2血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)及血清肌酐(serum creatinine， SCr)檢測 實驗結(jié)束小鼠腹腔麻醉后心臟取血, 一部分離心分離血清, 酶法測定BUN和Scr濃度[9]。所需試劑盒均購自南京建成科技有限公司。

2.3Western blotting檢測信號蛋白的表達 CLP大鼠腎臟組織置于勻漿器中，冰上勻漿后，加入蛋白裂解液及PMSF，冰上放置40 min，4 ℃、12 000 r/min 離心 40 min，取上清。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)，用Bradford法對上清進行蛋白定量，取20～40 μg蛋白樣品，10%SDS-PAGE，100 V轉(zhuǎn)移1 h至PVDF膜，放入封閉液中37 ℃ 1 h，Ⅰ抗4 ℃過夜；次日TBST洗膜5 min 3次，將膜與堿性磷酸酶標(biāo)記的抗IgG抗體孵育，室溫搖床上輕搖1 h，TBST洗膜5 min 3次，曝光，用圖像分析測定各吸光度值作定量分析。

2.4HK-2細胞培養(yǎng) HK-2細胞于10%胎牛血清+DMEM細胞培養(yǎng)液37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化、傳代。將HK-2細胞以2×108/L接種于6孔板，待細胞生長至70%～80%融合時，用無血清無添加因子的Keratinocyte-SFM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細胞生長同步化。然后將細胞置于無血清無添加因子的培養(yǎng)基中，分別用加入不同濃度的LPS(0、0.1、10和20 mg/L)培養(yǎng)12 h;而在另外一組加入10 mg/L LPS，然后培養(yǎng)不同時間(0～12 h)，收集細胞總蛋白，進行Western blotting檢測。

2.5Hoechst 33342和Annexin V/PI雙染定量和定性凋亡 將HK-2細胞以2×108/L接種于6孔板并分為4組：LPS刺激組、LPS+3-甲基腺嘌呤(3-me-thyladenine,3-MA)組、LPS+Akt inhibitor組和對照組(加PBS),抑制劑均購自Sigma。分組處理后，去除培養(yǎng)液，消化，離心，收集細胞，PBS洗2遍，加入5 μL Hoechst 33342染色液和5 μL PI染色液。混勻后，4 ℃孵育20～30 min，PBS洗1次，在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。同上培養(yǎng)，收集細胞后，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌2次，1 000 r/min離心5 min；用250 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，取100 μL細胞懸液于5 mL流式管中加入5 μL Annexin V和10 μL PI溶液，室溫避光染色10 min，加入300 μL PBS后用流式細胞儀檢測凋亡細胞、正常細胞、壞死細胞，對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。同時，離心收集細胞進行Western blotting檢測LC3的表達。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，進行方差分析和LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CLP大鼠腎臟發(fā)生明顯損傷

與假手術(shù)組比較，盲腸結(jié)扎穿刺動物普遍出現(xiàn)腎損傷，且隨著時間的推移，損傷程度加劇，出現(xiàn)腎小管上皮細胞膨脹，刷狀緣缺失，空泡變性，壞死，管型形成，細胞脫落等病理改變,見圖1A。與假手術(shù)組比較，CLP組動物在術(shù)后，隨著時間的推移，BUN和SCr均有上升,見圖1B、C。

Figure 1. The changes of kidney histopathology, blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine (SCr) in CLP and control (sham) rats. A： HE staining (×40)； B: BUN; C: SCr. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs sham group.

2 CLP大鼠腎臟自噬相關(guān)蛋白LC3、beclin-1含量及Akt磷酸化水平的變化

Western blotting結(jié)果表明，對照組(0 h)LC3表達較低，CLP發(fā)生6 h后開始上調(diào)，12 h達到最高峰，18 h有所下降;Beclin-1表達趨勢與LC3相同，見圖2A,證明CLP腎臟損傷時有顯著的自噬發(fā)生。Wes-tern blotting顯示細胞活化caspase-3蛋白表達水平升高，并呈時間依賴性，說明CLP腎臟損傷誘導(dǎo)了caspase-3介導(dǎo)的細胞凋亡，呈時間依賴性,見圖2A。Western blotting結(jié)果表明，對照組p-Akt表達較低，CLP發(fā)生2 h后開始上調(diào)，6 h達到最高峰，12 h有所下降;Akt在CLP腎臟損傷后隨時間的推移無明顯變化，見圖2B。

Figure 2. The protein expression of LC3, beclin-1,activated caspase-3 and p-Akt in renal tissues at different time points after CLP detected by Western blotting. A: expression of LC3, beclin-1 and activeated caspase-3; B: expression of p-Akt(308) and p-Akt(472). Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs 0 h.

3 體外細胞實驗檢測自噬相關(guān)蛋白LC3含量及Akt磷酸化水平

3.1不同濃度LPS刺激HK-2細胞后自噬相關(guān)蛋白的表達 Western blotting結(jié)果表明，體外不同濃度LPS刺激HK-2細胞后，對照組(未刺激組)p-Akt(308)表達水平較低，隨著刺激濃度的增加，p-Akt(308)表達水平逐漸提高；對照組(未刺激組)p-Akt(472)表達水平較低，0.1 mg/L LPS刺激后p-Akt(472)表達水平逐漸提高，10 mg/L LPS刺激組p-Akt(472)表達水平最高，20 mg/L LPS刺激組p-Akt(472)表達水平有所下降。LC3表達水平與p-Akt(472)表達變化趨勢一致，見圖3A。

3.2LPS刺激HK-2細胞后不同時點自噬相關(guān)蛋白的表達 Western blotting結(jié)果表明，對照組(未刺激組)p-Akt(308)表達水平較低，隨著刺激時間的延長，p-Akt(308)表達水平逐漸提高；對照組(未刺激組)p-Akt(472)表達水平較低，LPS 刺激4 h后p-Akt(472)表達水平逐漸提高，8 h p-Akt(472)表達水平最高，12 h p-Akt(472)表達水平有所下降。LC3表達水平與p-Akt(472)表達變化趨勢一致，見圖3B。

4 PI3K 信號通路抑制劑對LPS刺激HK-2細胞后自噬相關(guān)蛋白表達的影響

Western blotting分析表明，與LPS刺激組相比，抑制劑組(LPS+3-MA和LPS+Akt inhibitor組)LC3表達量顯著下調(diào)，見圖4A。Hoechst 33342和Annexin V/PI雙染進行細胞凋亡實驗，結(jié)果表明與LPS刺激組相比，抑制劑組(LPS+3-MA和LPS+Akt inhibitor組)HK-2細胞凋亡明顯增加(P<0.05)，見圖4B。

Figure 3. The protein expression of LC3 and p-Akt in HK-2 cells after LPS treatment at different time points and different concentrations. A: LPS treatment at 0, 0.1, 10 and 20 mg/L for 12 h; B: 10 mg/L LPS treatment at 0, 4, 8 and 12 h. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 0 mg/L or 0 h.

Figure 4. The levels of autophagy-related protein LC3 in HK-2 cells (A) and apoptosis of HK-2 cells (B) treated with LPS plus PI3K inhibitor or Akt inhibitor.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control; #P<0.01 vs LPS alone.

討 論

膿毒癥合并AKI患者死亡率明顯高于不伴AKI者，病死率超過70%[1]，成為危重病急救醫(yī)學(xué)面臨的急需解決的難題之一。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥所致AKI的發(fā)生機制不同于經(jīng)典的缺血再灌注引起的AKI[10]。過去認為膿毒癥合并AKI時的主要病理生理機制主要是腎小管管周微循環(huán)障礙導(dǎo)致腎臟低灌注，及腎臟缺血后引起的急性腎小管壞死(acute tubular necrosis,ATN)。然而，膿毒癥AKI死亡患者腎臟病理顯示，70%患者并無ATN發(fā)生，而腎小管上皮細胞凋亡更為常見[11]。另一方面，膿毒癥動物模型腎臟血流動力學(xué)結(jié)果顯示，近2/3提示腎臟缺血，而1/3提示腎臟血流量保持不變或增加，后者更接近人體發(fā)生膿毒癥的高動力型膿毒休克狀態(tài)[11]。在腎臟血流量不變甚至增加的情況下，腎小管上皮細胞仍然發(fā)生凋亡，提示腎臟血流動力學(xué)改變僅僅是膿毒癥引起腎臟損傷的一部分原因。而細菌內(nèi)毒素及其炎癥因子是誘導(dǎo)腎臟損傷的直接且重要的原因。以LPS為代表的內(nèi)毒素，刺激機體引發(fā)嚴重炎癥反應(yīng)，常常產(chǎn)生大量致炎癥因子如TNF-α和ROS，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激、線粒體損傷和能量耗竭，最終導(dǎo)致腎小管上皮細胞凋亡。在此過程中，細胞自噬對于腎小管上皮損傷和修復(fù)可能發(fā)揮了重要的作用。

自噬是真核細胞處于缺氧、饑餓或感染時，在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下，利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質(zhì)，為細胞修復(fù)、更新提供原料與營養(yǎng)、保持能量穩(wěn)態(tài)的過程，是有別于凋亡的另一種程序性死亡機制。凋亡的最終結(jié)局是細胞死亡，而自噬是細胞存活與死亡的一把“雙刃劍”[12]。同時兩者在一定程度上又密不可分：自噬為凋亡所需，自噬通常先于凋亡，進而啟動凋亡；適度的自噬抑制凋亡，保護細胞免于發(fā)生凋亡和壞死；自噬過度可以向凋亡轉(zhuǎn)化，共同促進細胞死亡[13]。目前關(guān)于自噬在腎小管上皮細胞中的研究多集中在缺血再灌注、藥物腎損傷和梗阻性腎病方面[14-16]。近年來有研究表明，自噬在膿毒癥的致病過程中發(fā)揮重要作用。膿毒癥患者肝臟組織及膿毒癥大鼠模型的心臟、肝臟中可觀察到自噬小體產(chǎn)生，同時伴有線體粒氧化損傷，證明膿毒癥時組織細胞有自噬現(xiàn)象[6-8]。此外，在CLP模擬腹膜炎及LPS腹腔注射這2種膿毒癥小鼠模型中都看到，敲除關(guān)鍵性自噬基因LC3及beclin-1后，炎癥因子IL-1β、IL-18等分泌明顯增加[17]，減少自噬將促進或加重炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致細胞死亡[18]，提示自噬在膿毒癥發(fā)病及炎癥反應(yīng)中起到重要作用。PI3K/Akt是一條經(jīng)典的存活信號通路，在細胞凋亡和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。PI3K可以使其下游分子Akt磷酸化。近些年來，在許多研究中證明了PI3K/Akt信號通路可以通過下游分子mTOR來調(diào)節(jié)自噬。

我們建立了CLP模擬腹膜炎大鼠膿毒癥模型，觀察腎小管上皮細胞是否自噬現(xiàn)象。觀察到隨著時間的推移，腎臟損傷程度加劇，出現(xiàn)腎小管上皮細胞膨脹、刷狀緣缺失、空泡變性、壞死、管型形成、細胞脫落等病理改變，同時BUN和SCr均有上升，提示CLP模擬腹膜炎大鼠膿毒血癥造成腎臟損傷的模型構(gòu)建成功。為了檢測CLP腎臟損傷時腎小管上皮細胞是否發(fā)生自噬，我們采用Western blotting檢測了自噬相關(guān)分子的表達，結(jié)果表明腎臟損傷自噬相關(guān)蛋白LC3、beclin-1含量及Akt磷酸化水平均隨著CLP腎臟損傷發(fā)生時間的推移表達上升。我們發(fā)現(xiàn)CLP后beclin-1 表達于6 h開始上調(diào)，12 h達最高峰，有趣的是beclin-1 表達量在18 h有所下調(diào)，可能由于長時間內(nèi)毒素刺激誘導(dǎo)腎小管上皮細胞大量凋亡，caspase-3過度活化，而活化的 caspase-3具有剪切 beclin-1 的作用[18]，從而導(dǎo)致beclin-1 表達下降。我們進一步在體外實驗證實了一定濃度的LPS可刺激腎小管上皮細胞發(fā)生自噬。不同濃度的LPS以及不同刺激時間均可促使HK-2細胞的自噬相關(guān)蛋白LC3及p-Akt表達量上升。同時，使用PI3K及Akt抑制劑后自噬相關(guān)蛋白的表達量有所下降，同時HK-2細胞凋亡明顯增加，提示PI3K/Akt信號通路可能對CLP腎臟損傷誘導(dǎo)的自噬有調(diào)節(jié)作用。

本研究通過建立經(jīng)典的膿毒癥AKI大鼠模型(CLP模型)和LPS細胞模型，明確膿毒癥時腎小管上皮細胞是否發(fā)生自噬；采用公認的自噬抑制劑3-MA和PI3K抑制劑觀察它們對膿毒癥腎小管上皮細胞損傷的影響，探討beclin-1及Akt是否通過通過促進自噬對膿毒癥腎小管上皮細胞的保護作用。本研究有助于揭示膿毒癥時腎小管上皮細胞損傷的新機制，為臨床干預(yù)膿毒癥AKI提供新的策略。

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