李 翔， 張曉艷， 趙繼敏， 劉康棟， 趙明耀， 董子明

(鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理生理學教研室，河南 鄭州 450001)

p21活化蛋白激酶(p21-activated protein kinases，PAKs)是一類絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶家族，它們最早是作為Rho GTP酶Cdc42和Rac1的特異性結(jié)合物而被發(fā)現(xiàn)的[1]。研究表明，PAK家族在細胞生長、細胞分裂、細胞凋亡，細胞遷徙以及內(nèi)分泌激素信號通路中起著重要的作用[2]。到目前為止，在哺乳類動物細胞中已經(jīng)有6個PAK家族成員被確定，PAK1～3屬于I類PAK家族，PAK4～6則屬于II類PAK家族[3]。在PAK家族的眾多成員中，PAK2的研究最為廣泛，因為它不僅可以促進細胞生長，也可以引起細胞凋亡。PAK2可以通過活化Akt1和ERKs，從而促進細胞的生長[4-5]；PAK2也可以在細胞凋亡信號的作用下被caspase-3、-8、-10切割并活化，產(chǎn)生一個活性片段PAK2-p34，這個片段進而從細胞漿轉(zhuǎn)移到細胞核中，引起細胞凋亡的發(fā)生[6]。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。目前乳腺癌的治療方法主要有：手術(shù)、放療、化療以及內(nèi)分泌治療，而在乳腺癌化療中所面臨的最大困難就是對化療藥物的耐藥問題。研究表明，對化療藥物耐藥的乳腺癌患者，其體內(nèi)某些生長因子受體的表達高于對化療藥物敏感的患者，例如：人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2, HER2)和胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor, IGF-1R)。這些生長因子受體的上調(diào)往往會引起其下游分子Akt、ERK、p38、PAK1等的激活或過表達，提示了這些生長因子受體以及其下游分子的過表達與修飾可能與乳腺癌患者對化療藥物的耐藥有關(guān)，但是具體機制目前尚未闡明。短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)是一種選擇性沉默基因表達的有效工具，對此，我們構(gòu)建了針對PAK2基因的shRNA表達質(zhì)粒pLK0.1-sh-PAK2，下調(diào)人乳腺癌MCF-7細胞中PAK2的表達，并探討其對MCF-7細胞增殖和凋亡的影響。

材 料 和 方 法

1 材料和主要試劑

大腸桿菌DH5α和人乳腺癌MCF-7細胞由本實驗室保存；人乳腺正常上皮細胞MCF-10A和人乳腺癌SK-Br-3細胞購于ATCC；PAK2和α-actin抗體購于Santa Cruz；PAK1抗體購于Cell signaling；限制性內(nèi)切酶AgeI和EcoR I購于NEB；T4 DNA連接酶購于大連TaKaRa; 去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購于Tiangen；jetPEI轉(zhuǎn)染試劑購于Polyplus；嘌呤霉素和Polybrene感染試劑購于Millipore；Annexin V/PI檢測凋亡試劑盒購于Invitrogen；CellTiter 96 AQueous單溶液細胞增殖檢測試劑盒購于Promega；DMEM培養(yǎng)基、BME培養(yǎng)基、胎牛血清和青、鏈霉素均購于Life Technologies。

2 方法

2.1shRNA靶序列的設(shè)計和合成 根據(jù)前期的實驗結(jié)果，選取針對PAK2干擾效果最好的靶序列：5’-CCAATCACAGTTTGAAACCTT-3’，按照pLK0.1質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，設(shè)計含有AgeI和EcoR I酶切殘端并能表達發(fā)卡結(jié)構(gòu)的2條寡核苷酸序列：5’-CCGGCCAATCACAGTTTGAAACCTTCTCGAGAAGGTTTCAAACTGTG-ATTGGTTTTTG-3’,5’-AATTCAAAAACCAATCACAGT-TTGAAACCTTCTCGAGAAGGTTTCAAACTGTGATTG-G-3’。同時，設(shè)計1對陰性對照序列，經(jīng)BLAST同源比對分析，此序列與所有人類基因編碼序列無同源性。所有序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

2.2pLK0.1-shRNA慢病毒表達質(zhì)粒的構(gòu)建 用限制性核酸內(nèi)切酶AgeI和EcoR I將pLK0.1空質(zhì)粒于37 ℃雙酶切2 h，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收酶切反應(yīng)產(chǎn)物。將合成的shRNA模板單鏈進行退火處理形成雙鏈，退火體系：20 μmol/L正、反義鏈模板各9 μL，10×Annealing Buffer 2 μL，加滅菌ddH2O至20 μL，置于95～100 ℃水浴中，自然冷卻至25 ℃。將純化后的線性載體與退火產(chǎn)物連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pLK0.1-shRNA-PAK2 (sh-PAK2)和陰性對照質(zhì)粒pLK0.1-shRNA-mock (sh-mock)。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌DH5α，涂布于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單個克隆，在含有氨芐青霉素(100 mg/L)的LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，用EcoRI和NcoI做雙酶切鑒定。將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序。測序引物為5’-CAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGA-3’。

2.3慢病毒顆粒的包裝和嘌呤霉素最適濃度的篩選 HEK-293T細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，以7×105cells/dish接種于60 mm培養(yǎng)皿中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)至70%～80%融合，使用jetPEI轉(zhuǎn)染試劑進行sh-PAK2和sh-mock病毒顆粒的包裝。包裝體系：pLK0.1-sh-PAK2質(zhì)粒1 μg，psPAX2質(zhì)粒750 ng，pMD2.G質(zhì)粒250 ng，加150 mmol/L NaCl至125 μL。轉(zhuǎn)染后12～15 h，棄去含轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基，加入新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集上清，離心，分裝，-70 ℃保存。MCF-7細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，以6×104cells/well接種于12孔板中，37 ℃、5%、CO2培養(yǎng)過夜。加入不同濃度的嘌呤霉素(1～10 mg/L)到MCF-7細胞培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細胞狀況并隔天換液。嘌呤霉素的最適濃度即培養(yǎng)3～5 d引起細胞死亡的最低濃度。

2.4病毒感染及穩(wěn)定表達細胞株的篩選 MCF-7細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，以1×106cells/dish接種于100 mm培養(yǎng)皿中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜，使用Polybrene感染試劑進行sh-PAK2和sh-mock慢病毒的感染。慢病毒感染體系：含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基9 mL，慢病毒顆粒1 mL，Polybrene 8 μL，加入到MCF-7細胞中。感染后24 h，換成含有最適嘌呤霉素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，同時設(shè)正常培養(yǎng)的MCF-7細胞作為對照。當對照組細胞全部死亡，而被病毒感染過的細胞生長良好時，說明感染成功，即已得到穩(wěn)定干擾PAK2的MCF-7細胞株。

2.5Western blotting免疫印跡法 裂解細胞并提取細胞總蛋白，用Bradford法檢測蛋白溶液濃度。取待測樣品40 μg進行SDS-PAGE，電泳后采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉1h后，加入相應(yīng)的Ⅰ抗稀釋液，4 ℃搖床孵育過夜。TBST緩沖液洗膜，5 min×4次，加入辣根過氧化物酶標記過的Ⅱ抗稀釋液，室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗膜，5 min×4次。加入ECL進行發(fā)光反應(yīng)，暗室曝光顯影。使用ImageJ軟件進行各蛋白條帶灰度值的測定。

2.6CellTiter 96 AQueous法檢測細胞體外增殖能力 取處于對數(shù)生長期的細胞，以1 000 cells/well種于96孔板中，每組設(shè)5個復(fù)孔并設(shè)不含細胞的空白對照。37 ℃、5% CO2連續(xù)培養(yǎng)4 d。每天于同一時點加入CellTiter 96 AQueous溶液20 μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h，使用多功能酶標儀檢測492 nm波長處的吸光值(A492)并繪制生長曲線。

2.7軟瓊脂集落形成實驗檢測細胞克隆形成能力 將含有0.5%瓊脂的BME培養(yǎng)基以3 mL/well平鋪于6孔板中，待完全凝固后，取處于對數(shù)生長期的細胞，以8 000 cells/well重懸于含有0.33%瓊脂的BME培養(yǎng)基中，平鋪在已經(jīng)凝固好的下層膠上面。每組設(shè)3個平行孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)1～2周。待克隆形成后，使用顯微鏡觀察克隆的大小并用Image-Pro Plus軟件進行克隆計數(shù)。

2.8流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 常規(guī)消化并收集各實驗組細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入預(yù)冷的70%乙醇，4 ℃固定過夜。離心，收集細胞，用1 mL PBS洗滌細胞1次，加入100 μL 1 g/L的RNase A重懸細胞，置于37 ℃孵育30 min，再加入400 μL 50 mg/L的PI，4 ℃避光孵育10 min后上機檢測。

3 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，對計量資料，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 pLK0.1-shRNA重組質(zhì)粒的鑒定

將重組質(zhì)粒用EcoR I和NcoI進行雙酶切鑒定。根據(jù)pLK0.1質(zhì)粒的特點，雙酶切后會產(chǎn)生5 kb和2 kb的2個片段。對酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進一步測序，經(jīng)過比對分析，4個重組質(zhì)粒中均含有目的shRNA片段，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖1。

Figure 1. Double restriction endonuclease digestion of pLK0.1-sh-PAK2 (Lane 1～2) and pLK0.1-sh-mock (Lane 3～4) by EcoR I and Nco I. M: 1 kb DNA marker.

2 PAK2在人正常乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞中的表達差異

Western blotting結(jié)果顯示，乳腺癌細胞組PAK2/β-actin比值明顯高于正常乳腺上皮細胞組(P<0.05)，見圖2。這說明PAK2在乳腺癌細胞中呈高表達狀態(tài)。

3 穩(wěn)定干擾PAK2的MCF-7細胞株的構(gòu)建

根據(jù)上步結(jié)果，MCF-7細胞中的PAK2表達水平高于SK-Br-3細胞，所以我們選擇MCF-7細胞作為穩(wěn)定干擾PAK2的細胞株。結(jié)果顯示，與sh-mock組相比，sh-PAK2組PAK2的蛋白表達水平明顯下調(diào)，約為sh-mock組的31.3%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);另外，PAK1的表達沒有明顯改變(P<0.05)，見圖3。這說明設(shè)計的shRNA是針對PAK2的特異性RNA片段，對PAK1的表達沒有影響。

Figure 2. The expression of PAK2 protein in breast cancer cell lines (MCF-7 and SK-Br-3) compared with a human non-tumorigenic mammary epithelial cell line (MCF-10A) detected by Western blotting. Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs MCF-10A.

4 沉默PAK2基因?qū)CF-7細胞增殖的影響

在接種細胞后1～4 d，用CellTiter 96 AQueous法檢測MCF-7細胞的體外增殖能力。與sh-mock組相比，sh-PAK2組從48h開始生長明顯減緩，細胞倍增時間延長，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。這說明沉默PAK2基因可明顯抑制MCF-7細胞的增殖。

5 沉默PAK2基因?qū)CF-7細胞克隆形成能力的影響

結(jié)果顯示，與sh-mock組相比，sh-PAK2細胞的集落形成數(shù)目及集落形成大小均明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖5。這表明下調(diào)PAK2的表達可有效抑制MCF-7細胞的克隆形成能力。

6 沉默PAK2基因?qū)CF-7細胞凋亡的影響

我們用十字孢堿(staurosporine)來誘導MCF-7細胞的凋亡。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，凋亡的發(fā)生呈濃度依賴性，而且與sh-mock組相比，sh-PAK2組凋亡的發(fā)生明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6。這說明下調(diào)PAK2的表達可以促進MCF-7細胞凋亡的發(fā)生。

Figure 3. The expression of PAK2 protein in MCF-7 cells treated with shRNA targeting PAK2 (sh-PAK2) detected by Western blotting. Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs sh-mock group.

Figure 4. The effect of PAK2 knockdown on MCF-7 cell prolife-ration. Mean±SD. n=3. *P<0.05. **P<0.01 vs sh-mock group.

Figure 5. The effect of PAK2 knockdown on anchorage-indepen-dent growth of MCF-7 cells (×300). Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs sh-mock group.

討 論

Rho蛋白是Ras超家族中最早被克隆出來的蛋白家族，它們是一組相對分子質(zhì)量在20～25 kD的GTP結(jié)合蛋白，具有GTP酶活性，因此，習慣被稱為Rho GTP酶[7]。Rho GTP酶在細胞骨架重組調(diào)控方面起著重要的作用，參與了對正常細胞增殖、分化、凋亡的調(diào)節(jié)，并與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8]。

PAKs是Rho GTP 酶家族的重要效應(yīng)物。PAKs是在上世紀90年代中期首先在大鼠腦的胞質(zhì)溶膠中被人們發(fā)現(xiàn)的[1]。通過篩選Rho GTP 酶的結(jié)合蛋白，人們發(fā)現(xiàn)了一組能特異性地結(jié)合Rac或 Cdc42的靶分子，后來被命名為PAK1 (α-PAK)、PAK3 (β-PAK)和 PAK2 (γ-PAK)。PAK1～3之間存在著嚴格的序列同源性, 它們均含有具有調(diào)節(jié)、黏附功能的N末端調(diào)節(jié)亞基, 和一個具有催化活性、進化上高度保守的C末端催化亞基。雖然PAK1～3在結(jié)構(gòu)上極為相似，但卻有著不同的組織分布：PAK1在腦、肌肉和脾臟中高表達，PAK3僅僅在腦組織中有所表達，而PAK2則在各組織器官中廣泛存在。

PAK2在PAKs家族中的作用最為獨特，因為它既可以促進細胞生長，也可以引起細胞凋亡。Men-ges等[5]的研究發(fā)現(xiàn)抑制PAK2的活性，可以引起Akt1和ERK1/2活性的下降，從而導致細胞生長的延緩。Jakobi等[4]發(fā)現(xiàn)活化的PAK2可以增加促凋亡蛋白Bad絲氨酸112和136位點的磷酸化，使其活性下降，從而抑制了細胞凋亡的發(fā)生，并且在腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)作用的早期，PAK2可以通過增強Akt、ERK和p38的活化來保護細胞免于死亡。然而，在細胞凋亡發(fā)生相對較晚的階段， PAK2將作為caspases(主要是caspase-3)的底物出現(xiàn)，被caspase-3切割在Asp212 位點，形成一個28 kD的N端片段和一個34 kD的C端片段(PAK2-p34)[9]。PAK2-p34進一步轉(zhuǎn)移到細胞核中，引起細胞凋亡的發(fā)生。由于Asp212位點在PAK3中是不存在的，在PAK1中又不被暴露，所以這個特性是PAK2 所特有的，而且這個過程的發(fā)生不僅可以促進PAK2的活化，而且為凋亡的發(fā)生提供了必要的形態(tài)學和生化學的改變。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，PAKs在許多人類腫瘤中高表達，包括：乳腺癌、宮頸癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和甲狀腺癌[10]。其中，PAK6在非小細胞肺癌組織里高表達，并且通過細胞骨架的重組促進肺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。我們的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PAK2 可以通過磷酸化c-Jun 的5個蘇氨酸位點(蘇氨酸2、8、89、93和286)，促進EGF 誘導的小鼠JB6 C141細胞的增殖和轉(zhuǎn)化[12]。Marlin等[13]的研究證實，PAK2 可以通過抑制caspase-3 的活性以及自身的被切割，使PAK2 活性較低的Hs578T 細胞相比較PAK2 表達較高的MDA-MB-468 細胞，對化療藥物誘導的細胞凋亡更加敏感，提示相比較誘導細胞凋亡的作用，PAK2更傾向于具有“癌基因”的效應(yīng)。

本研究首先觀察了PAK2在乳腺癌細胞中的表達情況，用正常乳腺上皮細胞MCF-10A作為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PAK2在乳腺癌細胞(尤其是MCF-7細胞)中高表達。在此基礎(chǔ)上，利用shRNA技術(shù)干擾PAK2在MCF-7細胞里的表達，Western blotting結(jié)果顯示PAK2的表達水平明顯降低(P<0.01)，證明合成的shRNA能有效沉默PAK2基因，下調(diào)PAK2的表達。由于PAK1和PAK2有著高度一致的序列同源性，Western blotting同時檢測了PAK1的表達，結(jié)果顯示，PAK1的表達水平與陰性對照組相比沒有顯著差異(P>0.05)，說明合成的shRNA只能特異性地沉默PAK2基因，對PAK1的表達沒有影響。接下來，采用CellTiter 96 AQueous法和軟瓊脂集落形成實驗檢測MCF-7細胞體外增殖能力的改變，結(jié)果顯示sh-PAK2組的細胞增殖被顯著抑制，生長速度明顯減緩，與此同時，克隆形成的大小和數(shù)目均明顯減少。十字孢堿是一種從鏈霉菌屬分離出來的生物堿，對腫瘤細胞的生長具有很強的抑制作用。我們用不同濃度的十字孢堿來誘導MCF-7細胞的凋亡，結(jié)果顯示，下調(diào)PAK2的表達能夠引起明顯的MCF-7細胞凋亡的增加，并且這種凋亡的增加呈濃度依賴性。綜上所述，本研究提示PAK2作為正調(diào)控因子介導了MCF-7細胞的增殖和轉(zhuǎn)化，干擾PAK2的表達可以增強MCF-7細胞對化療藥物的敏感性并促進細胞凋亡的發(fā)生。本研究表明PAK2有望成為乳腺癌治療的新靶標，并為PAK2抑制劑的研發(fā)提供一定的實驗依據(jù)。

Figure 6. The effect of PAK2 knockdown on apoptosis of MCF-7 cells detected by flow cytometry. Mean±SD. n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs sh-PAK2 group.

[參 考 文 獻]

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