戴 輝， 宋向群， 潘星辰， 彭海燕， 韋 江， 周韶璋△

(廣西醫(yī)科大學(xué) 1研究生院， 2附屬腫瘤醫(yī)院化療二科，廣西 南寧 530021)

分子靶向藥物在基因指導(dǎo)下的個(gè)體化治療已成為當(dāng)今非小細(xì)胞肺癌治療的共識(shí)。棘皮動(dòng)物微管結(jié)合蛋白樣蛋白4-間變性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule-associated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase，EML4-ALK)融合基因是近期發(fā)現(xiàn)的非小細(xì)胞肺癌新的分子亞型,其突變與表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)及Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS)突變是不共存的[1]，所以其信號(hào)通路的靶點(diǎn)研究臨床意義極大。人們研究發(fā)現(xiàn)，ALK包含許多重要的生物學(xué)信號(hào)通路，影響著腫瘤細(xì)胞增殖、分化與凋亡?？诉蛱婺?crizotinib)是近來(lái)發(fā)現(xiàn)針對(duì)ALK靶點(diǎn)的小分子抑制劑，它可以抑制ALK磷酸化及抑制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止于G1/S期。本研究針對(duì)含有EML4-ALK融合基因的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H2228，用crizotinib處理后，觀(guān)察ALK下游哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路的變化，以探討mTOR信號(hào)通路在crizotinib誘導(dǎo)的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H2228細(xì)胞凋亡中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細(xì)胞 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H2228由廣東省肺癌研究所贈(zèng)送，人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞由廣西醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)部提供。

1.2主要試劑與儀器 Crizotinib粉末制劑購(gòu)于Selleckchem， RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone，胎牛血清和胰蛋白酶替代物購(gòu)自Gibco，MTT購(gòu)自Amresco，總RNA小量制備試劑盒購(gòu)自Axygen康寧生命科學(xué)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa寶生物工程(大連)公司，定量PCR試劑盒購(gòu)自Roche，RNase-free water購(gòu)自生工生物工程有限公司，GoldView I型核酸染色劑購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司，電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠(chǎng)(型號(hào)為JY-ECPT3000)，凝膠成像儀購(gòu)自Bio-Rad,型號(hào)為170-8170，Western blotting儀器設(shè)備購(gòu)于Bio-Rad，ALK Ⅰ抗、p-ALKⅠ抗、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)Ⅰ抗、p-PI3KⅠ抗、AKTⅠ抗、p-AKTⅠ抗、mTORⅠ抗、p-mTORⅠ抗、70 kD核糖體蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase, 70-kD, p70S6K)Ⅰ抗、p-p70S6KⅠ抗和熒光Ⅱ抗均購(gòu)自Cell Signaling，BCA試劑盒購(gòu)自Merck，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD。

2 方法

2.1檢測(cè)H2228細(xì)胞與A549細(xì)胞EML4-ALK融合基因 培養(yǎng)H2228細(xì)胞與A549細(xì)胞到細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后，按總RNA小量制備試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA，用2%瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)所得總RNA的完整性，用微量分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度，EML4-ALK上、下游引物序列分別為：5’-ATCACTGTGCTAAAGGCGGCTT-3’和5’ -GAGCTTGCTCAGCTTGTACTCA-3’。按定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送華大生物科技有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。

2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 按照腫瘤貼壁細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)H2228細(xì)胞和A549細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按(6～10)×103cells/well的細(xì)胞密度接種于96孔板，預(yù)設(shè)置6個(gè)濃度，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按濃度梯度加入藥物，把細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，吸凈孔內(nèi)液體，加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h后再加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，充分振蕩10 min，在492 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度，分別計(jì)算出crizotinib對(duì)H2228細(xì)胞和A549細(xì)胞的IC50，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和周期分布情況 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H2228細(xì)胞與A549細(xì)胞，以4×105、5×105和7×105cells/well的細(xì)胞數(shù)量分別接種于6孔板中(2種細(xì)胞各接種8個(gè)孔)，培養(yǎng)24 h，加入crizotinib濃度為300 nmol/L的血清培養(yǎng)液，將按4×105cells/well接種的細(xì)胞培養(yǎng)72 h，按5×105cells/well接種的細(xì)胞培養(yǎng)48 h，按7×105cells/well接種的細(xì)胞培養(yǎng)24 h，以細(xì)胞凋亡試劑盒和周期試劑盒說(shuō)明書(shū)收集細(xì)胞并染色后用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率和周期分布，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2.4Western blotting檢測(cè)crizotinib對(duì)ALK/PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)蛋白表達(dá)的影響 收集長(zhǎng)滿(mǎn)瓶的H2228細(xì)胞和A549細(xì)胞，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，所得總蛋白經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上，ALKⅠ抗稀釋度1∶1 000，p-ALKⅠ抗稀釋度1∶1 500，PI3KⅠ抗稀釋度1∶1 000，p-PI3KⅠ抗稀釋度1∶1 500，AKTⅠ抗稀釋度1∶2 000，p-AKTⅠ抗稀釋度1∶1 500，mTORⅠ抗稀釋度1∶1 000，p-mTOR稀釋度1∶1 500，p70S6K稀釋度1∶1 000，p-p70S6K稀釋度1∶1 500，兔、鼠Ⅱ抗稀釋度1∶15 000，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作內(nèi)參照，紅外熒光Ⅱ抗(DyLight 680 conjugate)顯色，掃描分析條帶，以條帶灰度確定蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 H2228細(xì)胞與A549細(xì)胞的EML4-ALK基因測(cè)序結(jié)果

H2228細(xì)胞和A549細(xì)胞分別提取mRNA，提取產(chǎn)物通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增后電泳，發(fā)現(xiàn)在633 bp的位置有亮帶即EML4-ALK的位置，測(cè)序得出H2228細(xì)胞包含的EML4-ALK融合基因是變異體3(variant 3, V3)而且檢測(cè)到a亞型和b亞型。A549細(xì)胞由于不含有該融合基因故無(wú)法通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出目的DNA，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The DNA sequencing result of H2228 cells.The sequence in red box is the extra sequence of V3b compared with V3a.

2 MTT比色法檢測(cè)crizotinib對(duì)H2228細(xì)胞和A549細(xì)胞株生長(zhǎng)的影響

MTT實(shí)驗(yàn)計(jì)算得出H2228細(xì)胞的IC50為334.51 nmol/L。A549細(xì)胞對(duì)crizotinib的處理不敏感，給予10倍于H2228細(xì)胞的IC50后抑制率未及36%，見(jiàn)表1。

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及周期分布

根據(jù)MTT所得H2228細(xì)胞的IC50，以300 nmol/L作為實(shí)驗(yàn)的藥物濃度，在光鏡下觀(guān)察經(jīng)藥物處理后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(見(jiàn)圖2)。3組細(xì)胞未經(jīng)過(guò)處理時(shí)凋亡率無(wú)顯著差異(P>0.05)，經(jīng)crizotinib處理的H2228細(xì)胞24 h、48 h和72 h凋亡率較A549組和未加藥處理組明顯增加(P<0.05)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)凋亡率增大，見(jiàn)圖3。經(jīng)藥物處理的H2228細(xì)胞G2/G1：(96.26±0.80)%/(1.55±0.57)%，未經(jīng)過(guò)藥物處理的H2228細(xì)胞G2/G1：(14.49±2.16)%/(70.22±2.77)%，藥物處理使細(xì)胞明顯抑制在G1期，見(jiàn)圖4。

表1 細(xì)胞抑制率

Figure 2. Morphological changes of H2228 cells treated by crizotinib.The number of apoptotic cells was increased with the time of crizotinib treatment; even a blank area can be found after crizotinib treated for 72 h (the red circle).

Figure 3. Apoptotic rates of H2228 and A549 cells after treated with 300 nmol/L crizotinib at different time points.Mean±SD.n=4.*P<0.05 vs other groups.

Figure 4. Cell cycle distribution of H2228 cells after treaded with (A) or without (B) 300 nmol/L crizotinib for 72 h.

4 Western blotting檢測(cè)crizotinib對(duì)mTOR信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)蛋白表達(dá)的影響

300 nmol/L crizotinib處理EML4-ALK陽(yáng)性肺癌細(xì)胞株H2228 72 h發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶(phosphatidylinositol kinase-related kinases，PIKKs)蛋白家族成員中p-mTOR分子表達(dá)降低，其上游信號(hào)p-AKT、p-PI3K、p-ALK及下游信號(hào)分子p-p70S6K表達(dá)均降低，而在相對(duì)不敏感的EML4-ALK陰性細(xì)胞株A549中表達(dá)變化不明顯，見(jiàn)圖5。

Figure 5. Western blotting results of the protein expression levels in H2228 and A549 cells after treated with 300 nmol/L crizotinib for 72 h.

討 論

mTOR是PIKKs蛋白家族成員，可通過(guò)多條信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用，一條是生長(zhǎng)因子激活通路經(jīng)PI3K/AKT途徑，另一條是細(xì)胞外氨基酸通路，再一條是經(jīng)肝激酶 B1(liver kinase B1，LKB1)/AMP激活蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK]途徑。有研究顯示PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的活化與多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，它能夠加速細(xì)胞復(fù)制周期、減少細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移，在腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、卵巢癌等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2-4]，也有文獻(xiàn)證實(shí)PI3K可以被ALK信號(hào)所激活[5-7]，但具體機(jī)制尚未完明闡明。Crizotinib為針對(duì)ALK/c-Met雙靶點(diǎn)的小分子酪氨酸激酶抑制劑，進(jìn)入胞漿后與位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的酪氨酸激酶ATP結(jié)合域相結(jié)合，通過(guò)阻斷該通路的信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和促進(jìn)凋亡[8]，然而crizotinib誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制復(fù)雜,許多環(huán)節(jié)仍不清楚,有待進(jìn)一步研究。

我們的研究發(fā)現(xiàn)H2228細(xì)胞中含有EML4-ALK融合基因V3，且發(fā)現(xiàn)V3有2個(gè)亞型V3a和V3b，這與Martelli等[9]的研究結(jié)果相一致，該研究發(fā)現(xiàn)V3b比V3a多出的33 bp是來(lái)自于EML4的內(nèi)含子6，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也得到證實(shí)，但是否不同的亞型存在其它方面的差異仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)求證。在使用crizotinib作用EML4-ALK陽(yáng)性細(xì)胞株H2228時(shí), 其凋亡細(xì)胞百分率在早期即與對(duì)照細(xì)胞株A549有明顯差異，且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)和濃度的增加而增大，crizotinib處理的H2228細(xì)胞各時(shí)點(diǎn)和各濃度值凋亡細(xì)胞比例均大于壞死細(xì)胞，呈時(shí)間依賴(lài)性和濃度依賴(lài)性，在用crizotinib處理細(xì)胞后細(xì)胞的凋亡率顯著增加并且檢測(cè)出mTOR蛋白的活化形式p-mTOR水平降低，推測(cè)mTOR在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)方面有重要作用。目前認(rèn)為，在含有EML4-ALK融合基因的腫瘤細(xì)胞中持續(xù)活化的ALK通過(guò)依次磷酸化其底物蛋白，以聚集PI3K的p85亞基，并將信號(hào)傳遞給p110亞基，導(dǎo)致PI3K的激活；活化的PI3K 催化磷脂酰肌醇P2(phosphatidylinositol P2，PtdIinsP2)變成PtdIinsP3,兩者仍留在膜上,可以募集下游分子AKT到細(xì)胞膜上，PtdIinsP3可激活磷脂酰肌醇依賴(lài)性激酶1,后者可使AKT激活, 活化AKT的可直接激活mTOR,也可通過(guò)抑制結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物2(tuberous sclerosis complex 2，TSC2)與TSC1 形成復(fù)合物來(lái)激活mTOR信號(hào)，活化的mTOR可以磷酸化并激活P70S6K，使核糖體40S小亞基易于結(jié)合翻譯復(fù)合物，并提高5’-mTOR mRNA的翻譯效率[10]。為進(jìn)一步闡明mTOR在crizotinib誘導(dǎo)的EML4-ALK陽(yáng)性細(xì)胞凋亡中的分子機(jī)制，我們采用Western blotting法對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示H2228細(xì)胞在crizotinib的作用下EML4-ALK V3融合蛋白的表達(dá)量未受影響，但其活化形式p-ALK明顯受到抑制，這與Kim等[11]的研究結(jié)果相一致。Crizotinib靶向作用于ALK蛋白，抑制其酪氨酸激酶域的磷酸化，使其不能活化[12]，而且下游信號(hào)蛋白PI3K、AKT和mTOR的活化形式p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的表達(dá)水平都受到抑制，這與Tanizaki等[13]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中所示的p-AKT不受ALK抑制劑的影響不符，而與Kim等[11]的研究結(jié)果相同。在不含有EML4-ALK的A549細(xì)胞中由于不含有EML4-ALK融合蛋白，未見(jiàn)ALK蛋白的表達(dá)，這與Katayama等[14]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致；而且在A549細(xì)胞中未見(jiàn)到p-AKT和p-mTOR蛋白的表達(dá)水平受crizotinib的影響而下降，提示在含有EML4-ALK融合基因的H2228細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR通路的激活與ALK的活化密切相關(guān)[15-17]。在crizotinib處理的H2228細(xì)胞中mTOR下游蛋白p70S6K的活化形式p-p70S6K蛋白水平也降低，提示mTOR可能是通過(guò)下游蛋白p70S6K對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)控；而在A549細(xì)胞中雖然p-mTOR水平很高，但下游蛋白p70S6K的活化水平卻很低，提示在A549細(xì)胞中mTOR可能是通過(guò)細(xì)胞外氨基酸通路,或者是經(jīng)LKB1/AMPK途徑對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)控[10]，但還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)去證實(shí)。同時(shí)在對(duì)經(jīng)過(guò)crizotinib處理的H2228細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞停留在G1期，與Tumati等[18]所得研究結(jié)果一致。由于mTOR信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期方面有關(guān)鍵作用[19-20]，提示mTOR信號(hào)通路可能在G1/S期轉(zhuǎn)換過(guò)程中起重要作用。

本研究表明了PIKK蛋白家族成員mTOR在crizotinib誘導(dǎo)的EML4-ALK陽(yáng)性細(xì)胞株H2228凋亡中發(fā)揮了重要作用。由于crizotinib等酪氨酸激酶抑制劑類(lèi)藥物作用于靶細(xì)胞后，通常會(huì)引發(fā)多通路、多分子的后繼變化，通過(guò)對(duì)其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究，有助于遴選關(guān)鍵分子，采用有效的刺激誘導(dǎo)上調(diào)腫瘤細(xì)胞中相關(guān)促凋亡分子的表達(dá)水平或聯(lián)合“沉默”降低相關(guān)抗凋亡分子的表達(dá)，為肺癌治療探索的新方法，也為今后深入研究靶向耐藥機(jī)制提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)仍有一些不足,在以后的研究中可以進(jìn)一步追進(jìn)，如可以對(duì)mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵基因進(jìn)行敲除，培養(yǎng)敲除關(guān)鍵基因后的細(xì)胞，檢測(cè)mTOR信號(hào)通路上各關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平和活化水平，進(jìn)一步明確通路上各蛋白之間的關(guān)系，敲除關(guān)鍵基因的細(xì)胞用同樣條件的藥物處理，檢測(cè)此時(shí)的IC50和流式細(xì)胞周期和凋亡率是否發(fā)生變化，進(jìn)一步闡明mTOR信號(hào)通路在H2228細(xì)胞凋亡中所起的作用。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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