劉春生，羅海英，冼燕萍，王 斌，王 莉，羅東輝，郭新東

(廣州質量監(jiān)督檢測研究院，國家加工食品質量監(jiān)督檢驗中心(廣州)，廣州市食品安全檢測技術重點實驗室，廣州市食品安全風險動態(tài)監(jiān)測與預警研究中心，廣東 廣州 510110)

豆芽是人們喜食的一種傳統(tǒng)的物美價廉的蔬菜。但是，近年來“問題豆芽”事件頻頻曝光，一些豆芽生產作坊為了牟取最大利潤，使用國家明令禁止的植物生長激素、抗生素、殺菌劑等藥物，以達到縮短生長周期、增加產量、降低成本、使豆芽色澤鮮亮和延長保鮮期等目的。媒體報導的非法添加的藥物一般有6-芐氨基嘌呤、赤霉酸和對氯苯氧乙酸等植物生長促進劑，頭孢類和喹諾酮類抗生素，咪鮮胺等廣譜殺菌劑。此外，2,4-二氯苯氧乙酸也是一種常用的植物生長素，但其具有急性神經(jīng)毒性，對腎臟有損害，NY 5317—2006《無公害食品 芽類蔬菜》[1]中規(guī)定其限量值為0.1 mg/kg。從食品安全的角度來講，食品中殘留的植物生長激素、抗生素和殺菌劑等藥物會對人體產生一定的危害，長期食用會影響人體內分泌和代謝平衡等[2-3]。

國內外關于豆芽中相關藥物殘留的檢測方法報道較少，且主要集中在單一類型藥物的檢測，如2,4-二氯苯氧乙酸、6-芐氨基嘌呤等植物生長激素和喹諾酮類等藥物[4-15]，檢測方法以氣相色譜法[4-5]、液相色譜法[6]和色譜-質譜聯(lián)用法[7-16]為主。不同的檢測方法具有其特定的優(yōu)缺點：氣相色譜法需要進行衍生化反應，前處理操作繁瑣，且存在定性不足和靈敏度低等問題；液相色譜法不需要衍生處理，但同樣存在選擇性差、靈敏度低和易受復雜樣品基質干擾等問題；色譜-質譜聯(lián)用法結合了色譜的高分離能力和質譜的高鑒別能力，能夠實現(xiàn)準確定性定量，以減少誤判，而且可以簡化前處理、縮短檢測時間、提高檢測效率，是當前檢測痕量化合物殘留的主導技術，主要包括氣相色譜-質譜聯(lián)用法(GC/MS、GC-MS/MS)和液相色譜-質譜聯(lián)用法(LC/MS、LC-MS/MS)，其中串聯(lián)質譜法的多反應監(jiān)測(MRM)模式具有更好的選擇性和靈敏度，在食品中藥物殘留的檢測領域應用廣泛。

鑒于目前豆芽生產市場存在濫用多種類型藥物的情況，建立同時檢測豆芽中植物生長激素、抗生素、殺菌劑等多種不同類型藥物殘留的方法，對于提高檢測效率和加強監(jiān)管具有積極的意義。因此，本研究應用具有快速、簡單、廉價、高效、耐用、安全等優(yōu)點的分散固相萃取凈化技術(QuEChERS)[14-15, 17-21]，結合超高效液相色譜(UPLC)的快速分離以及串聯(lián)質譜(MS/MS) ESI電離源正、負模式分段掃描功能，優(yōu)化前處理和色譜、質譜條件，建立同時定性定量檢測豆芽中植物生長激素(6-芐氨基嘌呤、赤霉酸、2,4-二氯苯氧乙酸和4-氯苯氧乙酸)、抗生素(頭孢氨芐和諾氟沙星)與殺菌劑(咪鮮胺)的方法，以滿足對豆芽中殘留藥物監(jiān)測的要求。

1 實驗部分

1.1 主要儀器

AcquityTM超高效液相色譜和Waters XevoTMTQ MS 三重四極桿串聯(lián)質譜儀：美國Waters公司產品；高速組織搗碎機：德國IKA公司產品；MS3 basic漩渦混合器：德國IKA公司產品；KQ-250DV型數(shù)控超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司產品；LD5-2A離心機：北京京立離心機有限公司產品；5418高速離心機：德國Eppendorf公司產品；Milli-Q去離子水發(fā)生器：美國Millipore公司產品。

1.2 主要材料與試劑

6-芐氨基嘌呤、赤霉酸、2,4-二氯苯氧乙酸、對氯苯氧乙酸、頭孢氨芐、諾氟沙星和咪鮮胺標準品：德國Dr. Ehrenstorfer公司產品；乙腈、甲醇(HPLC級)：德國Merck公司產品；甲酸(HPLC級)：美國Sigma公司產品；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)和C18填料(40 μm)：美國Agilent公司產品；超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)：實驗室自制。

7種待測物標準品用甲醇-水溶解后，用甲醇配成單標儲備液，再用甲醇配成混標儲備液。臨用時，選用陰性試樣樣液配制所需濃度的系列基質校準工作溶液。

分析樣品(黃豆芽和綠豆芽)：均購自本地不同市場。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品的處理 稱取5.0 g搗碎混勻的樣品于50 mL玻璃比色管中，加入25 mL 0.1%甲酸甲醇，渦漩1 min，超聲提取20 min，取2 mL上清液于裝有50 mg PSA和150 mg C18的2 mL離心管中，渦漩振蕩2 min，以13 000 r/min離心5 min，吸取1.0 mL上清液至氮吹管，置于40 ℃水浴中，氮吹至干，用10%甲醇水溶液定容至1.0 mL，過0.22 μm濾膜，待UPLC-MS/MS測定。

1.3.2色譜條件 Acquity UPLC HSS T3色譜柱 (100 mm×2.1 mm×1.8 μm)；流動相：A為0.1%甲酸，B為乙腈；梯度洗脫程序：0.0～3.0 min、90%～40%A，3.0～5.0 min、40%～10%A，5.0～5.5 min、10%A，5.5～5.6 min、10%～90%A，5.6～7.5 min、90%A；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL；柱溫30 ℃。

1.3.3質譜條件 ESI正、負模式分段采集；ESI正模式下，毛細管電壓0.5 kV，ESI負模式下，毛細管電壓2.9 kV；正負模式切換20 ms；離子源溫度150 ℃；去溶劑氣溫度500 ℃；去溶劑氣(氮氣)流速800 L/h；錐孔氣(氮氣)流速50 L/h；碰撞氣(高純氬氣)流速0.15 mL/min；多反應監(jiān)測(MRM)模式。7種待測物的監(jiān)測離子對及錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)列于表1，每個離子對的駐留時間均為0.03 s。

表1 7種待測物的質譜分析條件Table 1 MS parameters for the analysis of 7 compounds

注：*為定量離子

2 結果與討論

2.1 提取條件的選擇

根據(jù)7種待測物的溶解性，對比了甲醇、0.1%甲酸甲醇、乙腈和0.1%甲酸乙腈的提取效果(與相應的基質標準溶液進行比較)，結果示于圖1?？梢姡?.1%甲酸甲醇的整體提取效果最好，因此，本實驗選擇0.1%甲酸甲醇作為提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑的提取結果Fig.1 Extraction results of the different extraction solvent

超聲提取是實驗室常用的提取方式，具有提取效率高、操作簡便等優(yōu)點。超聲提取時間會影響提取率，故本實驗分別考察超聲5、10、15、20、25、30 min對提取率的影響，結果示于圖2。圖2表明，超聲20 min已提取充分，故本實驗選擇超聲提取時間為20 min。

圖2 超聲時間的優(yōu)化Fig.2 Optimization of the time of ultrasonic extraction

2.2 凈化條件的優(yōu)化

實驗考察了PSA、C18和GCB三種吸附劑對7種待測物的吸附效果。分別稱取各50、100、150、200 mg PSA和C18兩種吸附劑，25、50、75、100 mgGCB吸附劑，置于2.0 mL 離心管中，各加入1.5 mL 50 μg/L混標溶液，經(jīng)渦旋、離心等處理后，通過檢測進行比較。結果表明：GCB對除頭孢氨芐外的6種待測物均有吸附，對諾氟沙星的吸附作用最強；PSA對2,4-二氯苯氧乙酸、4-氯苯氧乙酸、諾氟沙星、GA3都具有一定的吸附，吸附作用隨著PSA用量的增加而增強；C18對7種待測物的吸附作用較弱，其中對6-芐氨基嘌呤、赤霉酸、2,4-二氯苯氧乙酸的吸附作用隨著C18用量的增加而稍稍增強，C18用量為150 mg時，7種化合物的整體回收率最佳(86%～109%)。考慮到豆芽含有豐富的氨基酸和維生素，而PSA是一種弱陰離子交換劑，可以吸附脂肪酸、有機酸、碳水化合物等極性雜質，因此，進一步考察PSA和C18兩種吸附劑對濃度為50 μg/L基質混標溶液的吸附作用。實驗發(fā)現(xiàn)：PSA對待測物的吸附作用減弱，可能是由于基質競爭吸附而導致的；當PSA使用量為50 mg、C18使用量為150 mg時，儀器檢測獲得的響應值最大。因此，本實驗選用50 mg PSA和150 mg C18作為凈化吸附劑。

2.3 儀器條件的確定

在7種待測物中，咪鮮胺、頭孢氨芐和6-芐氨基嘌呤的分子結構中均含有氨基，在ESI正模式下獲得較高的[M+H]+峰；諾氟沙星分子結構中同時含有氨基和羧基，在ESI正、負模式下均有響應，但在正模式下的響應更高，信號更穩(wěn)定，故選擇ESI正模式檢測；赤霉酸、2,4-二氯苯氧乙酸和4-氯苯氧乙酸的分子結構中均含有羧基，在ESI負模式下獲得較高的[M-H]-峰。因此，本實驗選用ESI正、負模式切換對7種待測物進行分段掃描檢測。咪鮮胺和赤霉酸的一、二級質譜圖示于圖3。

圖3 咪鮮胺和赤霉酸的一級(a1和a2)和二級(b1和b2)質譜圖Fig.3 MS spectra (a1 and a2) and MS/MS spectra (b1 and b2) of prochloraz and gibberellic acid

植物生長激素類及抗生素類化合物的檢測多采用C18柱。本實驗比較了100 mm的HSS T3和BEH C18色譜柱對7種待測物的分離效果，發(fā)現(xiàn)T3柱對6-芐氨基嘌呤和赤霉酸的分離效果稍好，更有利于質譜的分段檢測，故選擇T3柱進行分離。單獨采用ESI正模式檢測時，流動相中加入甲酸，有利于提高待測物的電離效率，增強響應值；但對于ESI負模式，酸性流動相一般會抑制響應。由于本實驗采用ESI正、負切換模式檢測，選擇流動相時應該兼顧考慮。通過比較乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水兩組流動相體系，發(fā)現(xiàn)采用乙腈-水為流動相時，3種在ESI負模式下檢測的化合物響應值比采用乙腈-0.1%甲酸水為流動相時均提高約3倍，而4種在ESI正模式下檢測的化合物響應值下降了1～10倍。綜合考慮，本實驗選擇乙腈-0.1%甲酸水作為流動相。

7種待測物標準溶液在優(yōu)化好的儀器條件下的提取離子色譜圖示于圖4。

圖4 7種待測物標準溶液的提取離子色譜圖Fig.4 Selected ion chromatograms of the standard solution of 7 compounds

2.4 基質效應的校正

分別采用純溶劑和經(jīng)1.3處理的基質樣液配制0.4 ～ 100 μg/L范圍內6個濃度的混合標準溶液，按1.3條件進行測定，以峰面積y對質量濃度x(μg/L)繪制標準曲線，通過基質標準曲線的斜率與純溶劑標準曲線的斜率之間的比值考察基質效應。若比值小于1，說明基質抑制；若比值大于1，說明基質增強。7種待測物的斜率比值分別為：咪鮮胺0.96，頭孢氨芐0.57，諾氟沙星0.98，6-芐氨基嘌呤0.74，赤霉酸0.66，2,4-二氯苯氧乙酸0.81，4-氯苯氧乙酸0.58。結果表明，除咪鮮胺和諾氟沙星外，其余5種待測物存在一定的基質抑制效應。因此，本實驗采用空白基質標準溶液工作曲線進行定量，以校正基質效應。

2.5 線性關系、檢出限和定量限

濃度為0.4～100 μg/L的陰性基質標準溶液的標準曲線方程列于表2，可見，7種待測物的線性關系良好，相關系數(shù)在0.999 0～0.999 7之間。分別以S/N=3和S/N=10計算檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，結合前處理的稀釋倍數(shù)(5倍)，得到7種待測物的方法檢出限(MLOD)和方法定量限(MLOQ)。

2.6 方法回收率與精密度

選取自制陰性綠豆豆芽和黃豆豆芽樣品進行3個水平的加標回收實驗(與基質標準曲線校準)，6次平行實驗的結果列于表3?？梢?，在添加濃度范圍內，7種待測物在2種豆芽中的平均回收率在80.7%～115%之間，相對標準偏差(RSD，n=6)為2.6%～13.5%。

陰性黃豆豆芽樣品及其第1添加水平的提取離子色譜圖示于圖5。

3 結論

建立了以PSA和C18進行QuEChERS凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜在ESI正、負模式切換下測定豆芽中7種藥物殘留的方法。實驗優(yōu)化了提取和凈化條件、色譜和質譜條件等，考察了方法檢出限、基質效應、回收率、精密度等方法學指標。結果表明，該方法準確、靈敏、前處理簡單，具有良好的回收率和精密度，能夠滿足檢測豆芽中藥物殘留的要求，已應用于豆芽中7種藥物殘留的日常監(jiān)測工作。

表2 7種待測物在陰性豆芽基質中的線性范圍、線性方程和方法檢出限與方法定量限Table 2 Linear range, linear equation， MLOD and MLOQ of 7 compounds

表3 回收率和精密度測定結果(n=6)Table 3 Determination results of recoveries and precisions(n=6)

a. 陰性樣品；b. 加標樣品 圖5 陰性黃豆豆芽樣品及其第1添加水平的提取離子色譜圖Fig.5 Selected ion chromatograms of negative sample and its No.1 spiked

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