周麗華，陳安珣，趙肅清，于會(huì)娟

(廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006)

磷脂分析除了應(yīng)用薄層色譜、氣相色譜、液相色譜等傳統(tǒng)方法外，已出現(xiàn)不少新技術(shù)，如色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、軟電離質(zhì)譜、 P31核磁共振和熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)等，其中，基于質(zhì)譜的分析方法發(fā)展尤為突出。隨著鳥槍法、納米次級(jí)離子質(zhì)譜法、組織切片直接分析法等質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)，脂質(zhì)組學(xué)在疾病脂生物標(biāo)志物的識(shí)別、疾病診斷、藥物靶點(diǎn)及先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)、藥物作用機(jī)制研究等方面已展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。基質(zhì)輔助激光解吸-電離成像質(zhì)譜法(MALDI-IMS) 是最具代表性的磷脂組織切片直接分析技術(shù)，由Caprioli等[1]在基質(zhì)輔助激光解吸-電離質(zhì)譜(MALDI-MS)基礎(chǔ)上建立起來的。該技術(shù)將之前的質(zhì)譜只能分析提取或合成目標(biāo)物，擴(kuò)展到不經(jīng)任何分離純化手段就可直接分析細(xì)胞、生物組織切片，甚至是整個(gè)生物組織。MALDI-IMS利用離子掃描技術(shù)與專業(yè)圖像處理軟件，產(chǎn)生任意指定質(zhì)荷比(m/z)化合物的二維離子密度圖，可對(duì)組織中化合物的組成、相對(duì)豐度及分布情況進(jìn)行高通量、全面、快速的分析，已成為質(zhì)譜在臨床蛋白質(zhì)組學(xué)、糖組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)及藥物體內(nèi)代謝研究中的重要發(fā)展方向。MALDI-IMS的基本工作流程示于圖1，主要包括4部分：組織切片的制備(A)；基質(zhì)體系的確立與覆蓋(B)；質(zhì)譜分析方法(C)；數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及處理(D)。該技術(shù)能夠精確、快速識(shí)別不同表達(dá)水平的特定磷脂-蛋白細(xì)胞，能夠確定正常和患病器官中不同部位(包括腫瘤部位)的特定磷脂或蛋白質(zhì)的位置及相對(duì)濃度，能夠跟蹤包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的治療藥物及其代謝產(chǎn)物的空間分布，因此，在了解組織病理特征、疾病診斷、藥物療效及發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物等方面可能成為一種強(qiáng)有力的全新研究工具。此外，通過比較正常與疾病組織的分子分布，質(zhì)譜成像技術(shù)在腫瘤早期診斷、預(yù)后評(píng)估等臨床應(yīng)用中將扮演重要角色。目前，已有利用MALDI-IMS開展細(xì)胞或器官中磷脂分析和成像工作的研究。

基質(zhì)體系及其覆蓋方式是MALDI-IMS的關(guān)鍵部分，是獲得高質(zhì)量成像的瓶頸。由于測定對(duì)象復(fù)雜性的提高，如組織切片中雜質(zhì)含量高、目標(biāo)物結(jié)構(gòu)變化復(fù)雜且含量不均一、目標(biāo)物分子質(zhì)量變化范圍大等因素，對(duì)基質(zhì)體系的性能，如基質(zhì)濃度、基質(zhì)溶劑、基質(zhì)覆蓋方式、基質(zhì)高真空穩(wěn)定性等要求與MALDI-MS不一樣。為了從復(fù)雜的生物體系中直接獲取高質(zhì)量的分子分布圖，基質(zhì)體系的建立更加嚴(yán)格，除了要滿足作為MALDI基質(zhì)的幾個(gè)基本特征，如低的化學(xué)噪音和基質(zhì)相關(guān)離子峰的影響、在特定波長有較好的吸收率、在特定溶劑中有較好的溶解度、合適的酸堿性、較高的分析物分子電離效率外，同時(shí)還應(yīng)具備以下重要性質(zhì)：1)基質(zhì)必須有足夠的真空穩(wěn)定性，以保證較長的數(shù)據(jù)采集時(shí)間，且具有較好的耐激光輻射能力，尤其是耐高頻激光；2)基質(zhì)體系能產(chǎn)生均勻的結(jié)晶并能較好的覆蓋于組織表面，晶體的尺寸必須小于質(zhì)譜成像的分辨率，從而獲得高空間分辨率；3)基質(zhì)體系在相應(yīng)的基質(zhì)覆蓋方式下不引起明顯的分析物置換或位移[2]。

圖1 MALDI-IMS基本工作流程圖Fig.1 Workflow of MALDI-IMS

與其他生物分子相比較，磷脂自身有比較明顯的特點(diǎn)：1)有較低的分子質(zhì)量(<1 500 u) 和相近的質(zhì)荷比，可能與MALDI-MS/IMS中的基質(zhì)體系相關(guān)峰發(fā)生重疊，不利于磷脂的識(shí)別。2)水溶性低，要求所用溶劑對(duì)所測磷脂有一定的溶解性。3)多樣性的分子結(jié)構(gòu)，如根據(jù)極性頭的不同可分為磷脂酰膽(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)、甘油磷脂酸(PA)等；根據(jù)Sn-1和Sn-2位上(不飽和)脂肪酸鏈與甘油骨架之間的連接鍵，酯鍵、烷酰基鍵和烯烴?；I等的不同，可分為多個(gè)亞類。以上不同類型的磷脂往往同時(shí)存在，但極性頭的不同決定了它們不可能被同一檢測模式一次性檢測，如PC和PS易正離子化，而PE、PI、PA和PG則易負(fù)離子化。4)不同結(jié)構(gòu)磷脂的生物組織含量有明顯差異性。磷脂的上述特點(diǎn)要求建立適合自身的MALDI基質(zhì)體系。盡管目前已有不少化合物被證明可作為磷脂MALDI-MS分析的基質(zhì)，其詳細(xì)結(jié)構(gòu)示于圖2，但適用于MALDI-IMS的只有少數(shù)基質(zhì)體系。針對(duì)磷脂特點(diǎn)，為了獲得高質(zhì)量的MALDI-IMS譜圖，主要采用新基質(zhì)體系結(jié)合不同的基質(zhì)覆蓋方式提高對(duì)生物組織質(zhì)譜成像的質(zhì)量。近10年來，為了建立具有高真空穩(wěn)定性(穩(wěn)定存在2 h以上)、耐高頻率激光輻射、無基質(zhì)峰干擾、分布均勻且不引起分析物位移、能全面解吸-電離不同結(jié)構(gòu)與濃度的磷脂并準(zhǔn)確表征其空間分布情況的高效磷脂基質(zhì)體系，不少研究者進(jìn)行了大量的工作。本工作從基質(zhì)組成類型出發(fā)，簡述MALDI-MS/IMS用于生物組織磷脂分析和成像的基質(zhì)體系及制樣方法的相關(guān)進(jìn)展，并展望其發(fā)展前景。

1 單組分有機(jī)基質(zhì)體系及相關(guān)制樣方法

在MALDI-MS應(yīng)用發(fā)展過程中，單一組分有機(jī)固體化合物是最常見的用于分析各類目標(biāo)物的基質(zhì)類型，磷脂的MALDI-MS/IMS分析也不例外。

1.1 酸性有機(jī)基質(zhì)

肉桂酸衍生物(如芥子酸(SA)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA))和苯甲酸類衍生物(如2,5-二羥基苯甲酸(DHB))是最早用于磷脂分析的基質(zhì)類型。SA和HCCA 由于在較低m/z范圍內(nèi)(m/z<1 500)易產(chǎn)生強(qiáng)的基質(zhì)干擾峰，并且在有機(jī)溶劑(如甲醇)中溶解度較低，在磷脂的MALDI-MS/IMS中較少使用，但HCCA的使用偶見報(bào)道。劉祥等[3]以含0.2%三氟乙酸(TFA)的HCCA 50%甲醇水溶液為基質(zhì)，結(jié)合Image Prep基質(zhì)覆蓋儀，以正離子模式檢測了小鼠肝組織切片上700～900 u之間的5類共13種磷脂類分子，并指出了這些磷脂分子在組織內(nèi)分布的不均勻性。α-氰基-4-氯肉桂酸(ClCCA)是HCCA鄰位羥基被氯取代后的產(chǎn)物，由于氯原子的引入，使ClCCA相對(duì)HCCA具有較低的質(zhì)子親和力[4-5]。因此，ClCCA比HCCA表現(xiàn)出更好的基質(zhì)效果，可測定范圍更廣、種類更多的物質(zhì)。如ClCCA可高效檢測到常用磷脂基質(zhì)不能離子化的氯化PE，為直接分析炎癥機(jī)體脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生的中間體(一氯或二氯PE)提供可能性，打破了之前氯胺只能采用ESI-MS分析的局面，ClCCA檢測氯化PE的能力可能是因?yàn)樗芤龑?dǎo)氣相PE磷脂分子內(nèi)部的重排[6]。苯甲酸類衍生物DHB因其信噪比高、分析物碎片離子少、相關(guān)基質(zhì)峰不影響分析物鑒定的特點(diǎn)，被視為目前最適用于磷脂分析的基質(zhì)。此外，DHB具有較高的真空穩(wěn)定性和良好的有機(jī)溶劑溶解性能，這些特點(diǎn)也是其成為磷脂MALDI-IMS最常用基質(zhì)的關(guān)鍵因素。DHB可用乙醇-水(50∶50或90∶10，V/V，或添加0.1%三氟乙酸TFA)、乙腈-水(50∶50，V/V，或添加0.1%TFA)、甲醇-水(70∶30 或90∶10，V/V，或添加0.1%甲酸)、氯仿-甲醇(2∶1，V/V)等溶劑體系配制基質(zhì)溶液，以達(dá)到最大化解吸-電離磷脂的效果。少量TFA的存在可有效抑制磷脂的分解[7]，并在一定程度上增強(qiáng)脂質(zhì)的溶解性，有效提高磷脂(特別是PC和PI)的信噪比[7-8]。另外，進(jìn)行磷脂正離子模式MALDI-MS/IMS檢測時(shí)，在DHB基質(zhì)溶液中適當(dāng)添加陽離子試劑，如碘化鈉[9]、醋酸鈉[10]、氯化銫[11]等，可通過減少每個(gè)PL產(chǎn)生的陽離子絡(luò)合物類別而達(dá)到簡化譜圖的目的，此時(shí)，磷脂[M+Na]+峰或[M+Cs]+峰將取代[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+成為主要譜峰。

圖2 磷脂MALDI-MS/IMS 有機(jī)基質(zhì)的名稱和化學(xué)組成Fig.2 Structures and names of organic matrices for profiling and imaging of phospholipids by MALDI-IMS

基質(zhì)在組織分布中的均勻度是控制IMS實(shí)際空間分辨率的最主要因素。DHB最大的缺點(diǎn)是容易形成大針狀結(jié)晶，導(dǎo)致較低的點(diǎn)與點(diǎn)重復(fù)性和空間分辨率。為了彌補(bǔ)這一缺點(diǎn)，已有研究報(bào)道了幾種不同的基質(zhì)覆蓋方式，并取得了不錯(cuò)的效果，其裝置示于圖3。其中，基于溶劑的基質(zhì)覆蓋方法有：1)儀器自動(dòng)微點(diǎn)陣法，一般借助化學(xué)噴墨式打印機(jī)(如CHIP-1000)進(jìn)行，裝置示于圖3a。此方法可提高檢測靈敏度，但空間分辨率會(huì)有一定程度上的降低[12]，且相對(duì)費(fèi)時(shí)(一般需要1 h以上)。2)噴霧法可在較短時(shí)間內(nèi)(一般0.5～1 h)實(shí)現(xiàn)在切片上覆蓋相對(duì)小且分布均勻的基質(zhì)晶體[13]，其方法主要有自動(dòng)噴霧法(如電噴霧覆蓋法)、碰撞霧化法、自動(dòng)霧化噴霧器(如Image Prep基質(zhì)覆蓋儀法，示于圖3b)、手動(dòng)噴霧法(如薄層色譜溶劑噴霧法，示于圖3c)[14-15]和人工空氣噴槍法(示于圖3d)。上述幾種典型的基質(zhì)覆蓋方法的操作過程、注意事項(xiàng)及優(yōu)缺點(diǎn)在文獻(xiàn)[16]中有較詳細(xì)的描述，本工作則重點(diǎn)綜述各方法在磷脂分析中的應(yīng)用。 Amstalden van Hove 等[14]采用Image Prep對(duì)含0.1%TFA 的DHB乙腈水溶液(50∶50，V/V)進(jìn)行覆蓋，對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌病變模型進(jìn)行了PC類磷脂的分析和成像研究[14]。相對(duì)于手動(dòng)噴霧法，自動(dòng)噴霧法對(duì)儀器的要求高，費(fèi)用相對(duì)昂貴。薄層色譜溶劑噴霧法因其價(jià)格低廉、操作簡便成為較常用的噴霧方法，而人工噴槍法則更加經(jīng)濟(jì)實(shí)用。使用人工噴槍法，利用100 g/L的DHB乙醇水溶液(90∶10，V/V)對(duì)大鼠腦磷脂分析和成像時(shí)，可獲得更均勻的基質(zhì)分布，且能獲得比薄層色譜溶劑噴霧法更清晰明確的正離子PCs及負(fù)離子PIs的分布圖[17]； 為了解實(shí)施肝臟切割術(shù)(PH)后生物機(jī)體磷脂的變化，Miyamura等[18]利用人工噴槍法，將50 g/L含0.1%TFA的DHB甲醇水溶液(70∶30，V/V)均勻噴霧到實(shí)施肝臟切割術(shù)24 h后的小鼠肝臟和脂肪組織切片上，同時(shí)噴霧到組織磷脂類物質(zhì)分離用的TLC 板上，通過IMS技術(shù)對(duì)每片組織及TLC板上所分布的磷脂進(jìn)行成像分析，發(fā)現(xiàn)小鼠耳垂上PC類磷脂的變化與肝臟位置的變化相似，從而推測受傷后的肝臟可能會(huì)發(fā)送不可查明的信息給生物脂肪組織來管理脂質(zhì)代謝；Garrett等[19]使用人工噴槍法，將40 g/L含10 mmol/L 醋酸鈉的DHB甲醇水溶液(70∶30，V/V)均勻噴霧到采用平鋪技術(shù)處理后的眼睛組織上，分析其中磷脂的種類和分布，同時(shí)排查眼睛組織保存時(shí)受到的污染等情況，從而評(píng)價(jià)捐贈(zèng)眼睛的質(zhì)量。基質(zhì)溶液中的醋酸鈉作為離子化試劑，使磷脂分子鈉離子化，有利于磷脂分子在離子阱分析器中更穩(wěn)定的存在，便于在譜圖中提供更多的目標(biāo)物信息。人工噴槍法對(duì)操作人員技術(shù)要求不高，但要達(dá)到最佳基質(zhì)覆蓋效果需注意以下幾點(diǎn)[15]：1)噴霧應(yīng)在穩(wěn)定室溫，且有適宜濕度的環(huán)境中進(jìn)行。2)選用帶0.2 mm噴嘴的金屬空氣噴槍。3)噴嘴與切片的距離適當(dāng)。若距離太近，會(huì)導(dǎo)致過多基質(zhì)溶液噴霧到組織上，形成不均勻基質(zhì)晶體覆蓋，且導(dǎo)致分析物原位位移；若距離太遠(yuǎn)，則無足夠基質(zhì)溶液噴霧到組織上，達(dá)不到潤濕組織，將分析物原位提取的目的。

a.化學(xué)打印機(jī)[16]；b.自動(dòng)霧化噴霧器[16]；c.TLC 噴霧器[16]；d.人工噴槍[16]；e.毛細(xì)管振蕩霧化法(OCN)[20]；f.基質(zhì)升華法[22]圖3 用于磷脂MALDI-IMS 基質(zhì)覆蓋裝置Fig.3 Matrix application instruments for MALDI-IMS of phospholipids

MALDI-IMS的質(zhì)量分辨率、靈敏度、空間分辨率和再現(xiàn)性取決于基質(zhì)溶液覆蓋的效果?；|(zhì)溶液覆蓋方式對(duì)于脂類物質(zhì)，特別是能溶于甲醇、乙醇和乙腈等的磷脂物質(zhì)尤為重要。但基質(zhì)溶液中的有機(jī)溶劑在一定程度上會(huì)導(dǎo)致脂類在組織切片上產(chǎn)生遷移，嚴(yán)重影響IMS的空間分辨率。因此，一種經(jīng)濟(jì)且溶劑用量少的毛細(xì)管振蕩霧化法(OCN)被開發(fā)報(bào)道。此法利用毛細(xì)管尖端產(chǎn)生較小粒徑的小水滴或霧滴霧化基質(zhì)溶液，其主要特征是能夠產(chǎn)生較干燥的微小基質(zhì)顆粒，并最大可能地減少溶劑與組織的接觸，從而減少分析物的遷移，避免分子空間信息的損失，其裝置示于圖3e。通過OCN法將30 g/L含0.1%TFA 的DHB乙腈水溶液(50∶50，V/V)，覆蓋于患有hexb 基因特性的Tay-Sachs和Sandhoff 疾病模型的大鼠腦部切片上，能夠清晰地顯示出多個(gè)PCs、PS、PI分子在鼠腦中的分布輪廓圖[20]。

為了更有效地避免溶劑的使用，并消除溶劑給IMS法帶來的分析物擴(kuò)散問題，引入了兩種新型的無溶劑基質(zhì)覆蓋法。其中之一是基質(zhì)升華法，利用基質(zhì)升華達(dá)到蒸汽均勻分布在切片上的目的[21]，裝置示于圖3f。此法的顯著特點(diǎn)是能產(chǎn)生基質(zhì)微晶形態(tài)，增加基質(zhì)的純度和分布均勻性。Hankin等[21]利用此法獲得了比普通基質(zhì)覆蓋法質(zhì)量更高的鼠腦切片磷脂成像圖。2010年，該課題組再用此法詳細(xì)討論了23～70歲男性眼睛水晶體膜中磷脂，特別是隨著年齡增加SM類的變化情況[22]。基質(zhì)升華法雖然需要特殊的儀器裝置，但可有效地提高分析物的信號(hào)，形成均勻細(xì)小的基質(zhì)覆蓋層，減少由于基質(zhì)晶體尺寸對(duì)成像分辨率的限制。此法對(duì)操作者的技術(shù)要求不高，且分析速度快，可在幾分鐘內(nèi)完成，更重要的是不需要加入任何溶劑。另一種是無溶劑干燥涂層基質(zhì)覆蓋法[23]，將DHB粉末通過20 μm不銹鋼篩過濾，得到細(xì)小固體后直接涂于組織上。此法可獲得直徑為1～40 μm DHB晶體，由于分析物遷移量得到最小化，基質(zhì)覆蓋均勻且組織覆蓋率超過80%，從而可獲得更高質(zhì)量的磷脂MALDI-IMS成像圖。

DHB作為常用的磷脂基質(zhì)，因其自身結(jié)構(gòu)特性存在著不可避免的弱點(diǎn)：由于其酸性較高，負(fù)離子模式采集磷脂特別是PAs、PSs、PIs、PGs和PEs時(shí)，常因檢測靈敏度較低只能獲得信噪比低或無信號(hào)的譜圖；此外，在負(fù)離子模式下采集PLs混合物時(shí)，去質(zhì)子化的DHB會(huì)使目標(biāo)分子以比自身分子質(zhì)量大153 u的離子形式出現(xiàn)，增加譜圖解析的難度。

1.2 中性、低酸性和堿性有機(jī)基質(zhì)

為了克服酸性基質(zhì)的弱點(diǎn)，幾種中性、低酸性和堿性化合物被報(bào)道，用以進(jìn)一步提高磷脂分子負(fù)離子檢測的離子化效率和的靈敏度。圖1所示的基質(zhì)中，2,4,6-三羥基苯乙酮(THAP)較適合分析各類脂類物質(zhì)，但因其易形成較大結(jié)晶而較少用于IMS分析中。2,6-二羥基苯乙酮(DHA)是最常用的中性基質(zhì)，添加0.1%TFA的50%～70%乙醇或甲醇水溶液是其常用的溶劑，添加碘化銫[24]或氯化鋰[25]作為離子化試劑有利于磷脂的MS/MS分析。如對(duì)鼠腦切片心磷脂(CLs)[24]和PCs[25]的分析，基于各個(gè)磷脂分子的Cs+或Li+離子峰可獲得更多的結(jié)構(gòu)信息和更準(zhǔn)確的MS/MS數(shù)據(jù)。另外，Cs+的存在可在一定程度上提高組織上CLs的檢測豐度[24]。DHA相對(duì)DHB，在正、負(fù)離子下都有更好的檢測靈敏度、更高的分辨率和信噪比。DHA與中性基質(zhì)6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶(ATT)最突出的優(yōu)點(diǎn)是可檢測磷脂的非共價(jià)復(fù)合物，如可檢測到鼠腦切片中PC32∶0和PC34∶1與存在于基質(zhì)溶液中的氯異吲哚銨形成的非共價(jià)復(fù)合物，但高酸性基質(zhì)(如SA和HCCA)則無法檢測到相關(guān)信息[26]。然而，DHA在高真空30 min內(nèi)通常會(huì)升華，真空不穩(wěn)定，一般不適用于較長時(shí)間的 IMS數(shù)據(jù)采集(通常不超過1 h)。DHA升華所導(dǎo)致的基質(zhì)損失有時(shí)可通過增加基質(zhì)濃度解決[27-28]。如30 g/L含0.1%TFA 的DHA甲醇水溶液(70∶30，V/V)結(jié)合人工噴槍基質(zhì)噴霧法，對(duì)日本患者的300 μm×300 μm組織切片進(jìn)行IMS分析，成功揭示了人類結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移病變中磷脂的非正常分布情況[27]。 中性基質(zhì)ATT與基質(zhì)添加劑，如檸檬酸鹽(抑制磷脂金屬加合物)和離液試劑，氯化胍(GUA)(增加磷脂水溶性和OxPL的穩(wěn)定性)等組合，可高效地解吸-電離氧化磷脂(如OxPC、OxPE、OxPS等)，對(duì)人血漿痕量OxPL的檢測靈敏度可達(dá)fmol級(jí)[29]。 中性化合物2-巰基苯并噻唑(MBT)可分析各類脂類，相對(duì)DHB、DHA、PNA，在分析各類型PLs及腦和肝樣品原位磷脂成像時(shí)，MBT具有更好的基質(zhì)效果[30]，其較低的蒸汽壓能夠承受數(shù)小時(shí)的高頻率激光照射，可獲得輪廓分明的組織切片磷脂分布成像圖，其中性性質(zhì)可在負(fù)離子模式下鑒定出更多的腦和肝切片磷脂。通過噴霧覆蓋法，MBT甲醇飽和溶液可在切片上形成細(xì)而均勻的覆蓋層，獲得比DHB更好的空間分辨率和點(diǎn)與點(diǎn)的重復(fù)性。MBT易在m/z<500范圍內(nèi)產(chǎn)生基質(zhì)相關(guān)峰，通過添加CsCl使分析物因加Cs+而電離，從而使各磷脂相關(guān)峰在高出m/z132時(shí)出現(xiàn)，避免基質(zhì)相關(guān)峰的干擾。另外，CsCl的加入可使MBT檢測到更多磷脂分子，如肝臟中的GPEtn類。但利用MBT獲得的磷脂譜峰在m/z780～880進(jìn)行歸屬時(shí)存在不確定因素。此外，在利用MBT進(jìn)行IMS成像時(shí)發(fā)現(xiàn)，MBT易在負(fù)離子模式下產(chǎn)生大量高質(zhì)荷比(激光稍強(qiáng)時(shí)m/z可達(dá)3 000)的基質(zhì)簇峰，嚴(yán)重影響磷脂分析。

由于對(duì)硝基苯胺(PNA)對(duì)紫外光有較高的吸收，是一種可以代替DHB的堿性基質(zhì)。PNA可獲得比DHB更高的靈敏度，特別是在負(fù)離子模式下，PNA不僅可獲得更高信噪比的PGs和PSs信號(hào)，還可鑒定PEs和PEps，即使這些物質(zhì)同時(shí)存在于含有SMs和PCs的混合物中，也可獲得理想的分析效果[31]。但PNA較高的蒸汽壓制約了其在IMS中的應(yīng)用，盡管在PNA中添加CsCl能夠在一定程度上抑制其蒸發(fā)[32]，但仍不能滿足對(duì)較大組織切片進(jìn)行較長時(shí)間(約2 h)IMS分析的要求。

9-氨基吖啶(9-AA)作為基質(zhì)最先由 Vermillion-Salsbury 和 Hercules于2002年測定肽解液時(shí)引入[33]，因其產(chǎn)生的基質(zhì)干擾峰較少，主要用于測定分子質(zhì)量小的物質(zhì)，如代謝產(chǎn)物或磷脂。9-AA對(duì)磷脂的測定，在正、負(fù)離子模式下均比DHB的檢測靈敏度高，磷脂以單一質(zhì)子化峰電離，無加鈉離子峰干擾。測定脂類混合物時(shí)，9-AA不電離膽固醇、三?；视王ヮ愇镔|(zhì)，可有效地降低對(duì)脂類混合物中磷脂分析的復(fù)雜性[34]。9-AA(pK=9.99)相對(duì)其他常用基質(zhì)具有更強(qiáng)的堿性，這有利于PE類磷脂以負(fù)離子模式測定，可避免正離子模式測定中PC對(duì)PE信號(hào)的抑制問題。9-AA基質(zhì)溶劑的組成對(duì)獲得的磷脂譜圖有較大影響，通過優(yōu)化溶劑組成可改善基質(zhì)與分析物的作用力。甲醇、乙腈、異丙醇相比，異丙醇-乙腈混合溶劑(60∶40，V/V)可使9-AA對(duì)PC測定的信噪比提高30倍[34-35]。另外，在無溶劑的情況下，9-AA 干粉可與凍干組織膜，如嗜鹽古生菌(halobacterium salinarum)一起研磨，通過壓片法形成細(xì)薄片樣后直接分析，此法免去了破膜、磷脂分離提純等步驟，可快速獲得膜上的磷脂信息，開創(chuàng)了生物膜直接測定的新方法[36]。但在負(fù)離子模式下，9-AA易將PCs類磷脂去甲基后離子化，常被誤為PEs，導(dǎo)致歸屬錯(cuò)誤[37]，因此，在測定含有PC和PE的混合樣品時(shí)應(yīng)注意此點(diǎn)。盡管如此，9-AA卓越的負(fù)離子化PLs能力引起了廣泛的關(guān)注。Cerruti等[38]采用噴霧法，利用10 g/L的9-AA乙醇水溶液(70∶30，V/V)對(duì)鼠腦切片磷脂進(jìn)行了負(fù)離子模式的IMS分析，與HCCA、DHB、THAP相比，更多的磷脂分子被9-AA成像分析，包括PA、PE、PS、PG、PI、PIP、ST在內(nèi)的28個(gè)脂質(zhì)分子得到清晰的分布圖，并通過MS/MS分析得到歸屬確認(rèn)。另外，也有9-AA用于老鼠腎臟器官中SM3與SB1的硫脂復(fù)合物的IMS分析報(bào)道[39]。

Calvano等[40]采用另一強(qiáng)堿性物質(zhì)1,8-雙二甲基氨基萘(DMAN)，又稱 “質(zhì)子海綿”(proton sponge)，在無任何分離提純步驟的情況下，直接分析生物膜中磷脂，對(duì)格蘭氏陽性菌(乳酸菌)Lactobacillussanfranciscensis和胚芽乳汁桿菌L.plantarummicroorganisms的分析結(jié)果表明，此基質(zhì)在負(fù)離子模式下可在低于皮摩爾的檢測限下離子化磷脂，并且?guī)缀鯚o基質(zhì)干擾峰。苗楠等[41]采用堿性化合物3,4-二氨基苯基苯甲酮(DABP)含3%HCl的甲醇水溶液(80∶20，V/V)為基質(zhì)體系，分析不同種類的磷脂，發(fā)現(xiàn)此基質(zhì)體系能有效抑制堿金屬離子加成，簡化譜圖，從而利于磷脂的鑒定。此體系與DHB 和HCCA相比，能以更低的激光能量解吸-電離磷脂，獲得更高的信噪比和更低的檢測限。

2012年，Thomas等[42]詳細(xì)討論和對(duì)比了DHB、HCCA、DHA、THAP、3-羥基吡啶甲酸、DMAN、1,8,9-蒽三酚(DIT)、1,5-二氨基萘 (DAN)、PNA、9-AA、2-MBT等12種有機(jī)物質(zhì)作為升華法的基質(zhì)效果，發(fā)現(xiàn)另一個(gè)高效堿性基質(zhì)DAN能在正、負(fù)離子采集模式下獲得更清晰的鼠腦及魚切片磷脂成像譜圖，且具有更高的真空穩(wěn)定性及小于20 μm的空間分辨率。

2 多元有機(jī)基質(zhì)體系及相關(guān)制樣方法

2.1 離子型基質(zhì)體系

具有低熔點(diǎn)的鹽類物質(zhì)，或稱“室溫離子液體”RTILs(room temperature ionic liquids)，具有極高的真空穩(wěn)定性(可忽略的蒸汽壓)和熱穩(wěn)定性，且溶液分布均勻，是極具應(yīng)用前景的一類基質(zhì)體系?；贖CCA發(fā)展的離子基質(zhì)，如HCCA/正丁胺[43-44]、HCCA/1-甲基咪唑、HCCA/嘧啶、HCCA/三丙胺、HCCA/三丁胺和HCCA/苯胺，在離子化效率、信噪比、靈敏度、分辨率、重現(xiàn)性、檢測物數(shù)量、耐污染程度等方面均表現(xiàn)出比單一基質(zhì)更優(yōu)越的性能[44]，磷脂在離子基質(zhì)的輔助下可更加穩(wěn)定，不易碎裂[43]。 將40 g/L含0.1%TFA的HCCA/正丁胺的甲醇水溶液(75∶25，V/V)與DHB/正丁胺(DHBB)離子基質(zhì)一同被用于小鼠肝臟與小腦切片磷脂分析和成像[45]，利用人工噴槍噴霧覆蓋，兩種離子基質(zhì)均比HCCA、DHB、DHBB、PNA、DHAP、9-AA、CHCAB 獲得了更高的分析信噪比，檢測到更多的磷脂分子。Calvano等[46]利用另一離子基質(zhì)HCCA/三丁胺的甲醇溶液，通過修改Bligh-Dyer脂質(zhì)提取程序，對(duì)含有榛子油(HO)的特級(jí)初榨橄欖油(EVOO)進(jìn)行磷脂提取和富集，建立基于MALDI-MS的EVOO摻假分析。在此研究中，HCCA/三丁胺既作為磷脂提取溶劑，又作為MALDI 基質(zhì)，僅選擇性地從脂類混合物中高效解吸/電離磷脂。此法創(chuàng)立了基于PLs含量不同，鑒別具有高度相似性的HO和EVOO的方法。

由于ClCCA表現(xiàn)出比HCCA更優(yōu)秀的基質(zhì)效果，基于ClCCA發(fā)展起來的離子液體基質(zhì)(ILM)或液體支持基質(zhì)(liquid support matrix：LSM)[47]若被用于磷脂成像分析，則有望取得更佳的效果。

基于PNA化合物發(fā)展起來的離子基質(zhì)PNA/丁酸能以[M+H]+的方式離子化溶血PC、PC和PAF，以[M+Na]+離子化PG、PA、PS，更大程度上簡化譜圖[48]。在正離子模式下，PNA/丁酸可同時(shí)檢測含PCs、SMs、PAFs、PEs的磷脂混合物，能消除這些不同類磷脂之間的離子化抑制效應(yīng)。

2.2 多元混合有機(jī)基質(zhì)體系

多元混合有機(jī)基質(zhì)由兩種或兩種以上化合物混合而成，有效的多元混合有機(jī)基質(zhì)體系不僅能夠充分發(fā)揮單一基質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，而且通過優(yōu)化制樣可克服單一基質(zhì)的缺點(diǎn)。

2011年，課題組與Shanta等[49]共同研究報(bào)道了一個(gè)新混合基質(zhì)，每毫升含7 mg HCCA和7 mg DHB的甲酸水溶液(70∶30，V/V)，利用Image Prep進(jìn)行基質(zhì)覆蓋，對(duì)鼠腦磷脂進(jìn)行了IMS分析。此基質(zhì)體系與單一基質(zhì)相比，雖在基質(zhì)峰干擾上未有明顯改進(jìn)，但其具有更高的真空穩(wěn)定性，一次進(jìn)樣可獲得正、負(fù)兩種模式的成像數(shù)據(jù)。哌啶的存在可使基質(zhì)溶液更有效地將磷脂從切片上原位萃取出來，可檢測到更多磷脂分子，獲得更高的分辨率。同年，Kim等[50]采用手動(dòng)滴液干燥法，將此基質(zhì)體系溶液滴加到患有肝內(nèi)肝膽管型肝癌和其他可能患肝癌的腺癌病人的組織切片上，進(jìn)行磷脂表達(dá)差異性分析。2012年，Shanta等[51]再次利用此基質(zhì)體系，并結(jié)合Image Prep法，通過IMS對(duì)正常鼠腦及腦缺血切片進(jìn)行磷脂表達(dá)差異性分析，獲得了與腦缺血疾病相關(guān)的GPC、PC、PE、SM磷脂類變化的生物標(biāo)記物的相關(guān)信息。

10 g/L含0.1%TFA的HCCA乙腈水溶液(50∶50，V/V)與同濃度的9-AA乙腈水溶液(50∶50，V/V)等體積混合，形成了另一個(gè)可用于磷脂分析的混合基質(zhì)體系，其特點(diǎn)是在正離子模式下能以較低激光能量解吸-電離PC，無基質(zhì)相關(guān)峰干擾[52]。

3 “無基質(zhì)”體系及相關(guān)制樣方法

為進(jìn)一步避免低質(zhì)荷比區(qū)來自基質(zhì)相關(guān)峰的干擾，提高分析靈敏度、重復(fù)性、空間分辨率，避免分析物原位位移，不同形式的“無基質(zhì)”的LDI-MS/IMS被引入。

3.1 基于各種材料的“無基質(zhì)”體系

近年來，基于硅、碳、金屬等元素發(fā)展起來的“無基質(zhì)”材料體系，因具有獨(dú)特的熱、電、光物理和化學(xué)性能，相比有機(jī)化合物更有利于各類物質(zhì)的LDI-MS分析。各種“無基質(zhì)”材料體系的發(fā)展，大大促進(jìn)了LDI-MS/IMS在基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、糖組學(xué)、代謝組學(xué)及其他小分子(特別是分子質(zhì)量小于1 500 u)物質(zhì)分析領(lǐng)域中的應(yīng)用[53-57]。描述這些“無基質(zhì)”的LDI-MS新名詞有：表面(或材料)輔助(或加強(qiáng))激光解吸-電離質(zhì)譜(SALDI-MS、SELDI-MS和MELDI-MS)，凝膠溶膠輔助激光解吸-電離質(zhì)譜(SGALDI-MS)，納米顆粒輔助激光解吸-電離質(zhì)譜(nano-PALDI-MS)等。

基于硅元素的材料有多孔硅(DIOS)、10～40 nm硅納米線、硅酸鹽介孔材料、SiO2芯片、納米級(jí)SiO2顆粒及基于硅氧烷結(jié)構(gòu)的聚合物凝膠溶膠體系等。He等[58]將DIOS與待測組織或細(xì)胞接觸，將分析物轉(zhuǎn)移到DIOS表面后分析，成功獲得了HEK293細(xì)胞的生物磷脂標(biāo)志物PC的特征碎片離子峰m/z184.1，并對(duì)HEK293細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。DIOS常用恒電流蝕刻法獲得主要用于分析質(zhì)量小于3 000 u的分析物，分析物通過納米孔隙捕捉，同時(shí)吸收激光能量，完全避免了基質(zhì)峰背景干擾，表面光滑且具較大孔徑的硅材料則無此基質(zhì)效果[59]。DIOS的主要缺點(diǎn)是使用壽命短(一般不到1年)，再利用率低，對(duì)污染物敏感[60]。

基于碳元素的材料有石墨、碳納米管、富勒烯、富力烯、類納米金剛石型碳等。Peng等[61]將懸浮于異丙醇的膠態(tài)石墨懸濁液通過TLC噴霧器覆蓋在分離磷脂的TLC板上，進(jìn)行PCs和SMs分析。Cha等[62]采用人工噴槍將上述膠態(tài)石墨懸濁液用異丙醇稀釋4倍后，覆蓋于鼠腦切片上進(jìn)行磷脂成像分析，通過固定噴槍和樣品靶位置即可在切片上覆蓋均勻的石墨異丙醇膠態(tài)溶液。此材料體系若過多覆蓋或受到較大激光能量照射，會(huì)增加來源于膠態(tài)石墨中碳簇峰的背景噪音及m/z413、449未知峰的干擾。他們還發(fā)現(xiàn)，膠態(tài)石墨能高效解吸-電離腦苷脂，這是一類DHB等常用基質(zhì)在正離子模式下很難檢測到的脂類物質(zhì)。富勒烯(C60)功能化后可提高其作為基質(zhì)材料的靈敏度，并克服“熱點(diǎn)”現(xiàn)象。Woods等[63]采用C60(C11H23)n(n=6)成功地分析了各類磷脂，特別是硫酸腦苷脂，通過離子淌度分析器獲得的二維譜，能明確區(qū)分脂類和其他類物質(zhì)。C60(C11H23)n不易產(chǎn)生背景干擾，且在氯仿中有極高的溶解性能，適合脂類等脂溶性物質(zhì)的分析。2008年，類納米金剛石碳材料覆蓋的DVD整體裝置首次被Naiam-ul-hag等[64]引入到脂類LDI-MS分析中。該裝置由納米金剛石類型碳材料涂層(DLC)，金屬鉬濺射層和數(shù)字多功能光盤層(DVD)組成。DLC特殊的熱、電、光及化學(xué)性能和涂層中存在的大量空格可有效輔助LDI分析低分子質(zhì)量的肽類和代謝物質(zhì)，如PC等。DLC層表面粗糙，含Csp3和Csp2，對(duì)305～330 nm波長有較強(qiáng)吸收，可避免使用長脈沖激光，從而減少分析物的裂解。DLC表面極高的疏水性可對(duì)分析物起到預(yù)濃縮的效果，提高分析靈敏度；中間Mo層可避免DVD受激光照射，減少背景干擾，同時(shí)可對(duì)DLC層進(jìn)行電荷耗散。這一體系可獲得的分析靈敏度高于DIOS，與硅酸鹽介孔材料相當(dāng)，具有高重復(fù)性、強(qiáng)耐鹽性、易處理、可重復(fù)使用且不易污染等特點(diǎn)，還可避免在使用碳納米管和富勒烯材料時(shí)，常出現(xiàn)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)產(chǎn)生較大質(zhì)量漂移的現(xiàn)象。

基于金屬及其氧化物納米顆粒的材料有：Au、Ag、Mn、Zn、Fe2O3、TiO2、ZnO 等。如Jackson等[65]利用人工噴槍將金膠體(5.5 nm)的乙醇溶液覆蓋在鼠腦切片上進(jìn)行腦苷脂分析[65]。Taira等[66]利用功能化的硅酸鹽材料側(cè)邊修飾2個(gè)赤鐵礦(Fe2O3)單元電池(剛玉結(jié)構(gòu))，獲得功能化的納米顆粒(fNPs)，采用人工噴槍噴霧對(duì)鼠腦切片進(jìn)行多肽和脂類物質(zhì)分析，特別是PC類的IMS分析。fNPs直徑為3.7～0.1 nm，表面修飾有羥基和氨基，可大大增加分析物的離子化效率。使用fNPs可獲得低于15 μm的空間分辨率，并可避免分析物原位遷移。另外，在m/z0～10 000區(qū)域內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生任何來源于fNPs的背景信號(hào)。2009年，該研究小組再次使用fNPs在負(fù)離子模式下對(duì)大鼠海馬組織中硫脂及PSs類磷脂進(jìn)行了IMS分析[67]。

3.2 基于其他光源解吸-電離的“無基質(zhì)”體系

紅外激光直接解吸-電離磷脂是另一“無基質(zhì)”體系的方法[68-69]，分析前將醋酸鉀溶液噴霧覆蓋于切片上，可對(duì)神經(jīng)組織膜中磷脂和糖脂類物質(zhì)進(jìn)行正交IR-LDI-IMS分析。該方法極少有脂類碎片產(chǎn)生，可獲得高空間分辨率的成像譜圖，不會(huì)導(dǎo)致分析物在切片上擴(kuò)散或遷移。

4 展望

在MALDI-MS/IMS的應(yīng)用及發(fā)展進(jìn)程中，與基質(zhì)相關(guān)的研究一直是分析工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)。為進(jìn)一步促進(jìn)MALDI-MS/IMS對(duì)磷脂類物質(zhì)的分析和成像技術(shù)進(jìn)展，重點(diǎn)仍在于減少背景峰干擾、增加制樣均勻度、提高分析靈敏度和重復(fù)性、提高成像的空間分辨率、減少分析物組織上的位移，這些都有待于新基質(zhì)，尤其是高效新基質(zhì)或特殊“基質(zhì)”的發(fā)現(xiàn)及相應(yīng)基質(zhì)覆蓋方法的引入。在以有機(jī)化合物為主要成分的基質(zhì)體系發(fā)展中，單組分有機(jī)基質(zhì)將側(cè)重于對(duì)已有高效基質(zhì)的結(jié)構(gòu)改造，或基于此的多元及離子基質(zhì)的制備，以獲得更高基質(zhì)性能的新體系，或改善其真空穩(wěn)定性(如DHA、PNA、THAP)，滿足IMS較長時(shí)間采樣的需要；多元組成及離子基質(zhì)，特別是RTILs基質(zhì)，在磷脂中有較高的利用空間和開發(fā)應(yīng)用前景；“無基質(zhì)”的材料體系在磷脂分析中的報(bào)道還相對(duì)較少。另外，在磷脂成像過程中的基質(zhì)覆蓋方法不多，可直接引用其他類型物質(zhì)成像過程中使用的基質(zhì)覆蓋方法，如噴霧-滴液二層法[70]及干-濕二層法[71]等。

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