郝 穎，于珊珊，戴雨霖，張 穎，鐘 薇，劉淑瑩，越 皓

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117)

人參為五加科人參屬植物人參(panaxginsengC. A. Meyer)的干燥根，是我國名貴的中藥材之一，具有安神益智、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等功效[1-2]，而人參皂苷是人參中的主要活性成分[3]。人參皂苷屬三萜類化合物，按照其皂苷元結(jié)構(gòu)的不同，可大致分為3類，分別是原人參二醇型皂苷(Protopanaxadiol，PPD)，原人參三醇型皂苷(Protopanaxatriol，PPT)和齊墩果烷型人參皂苷(Oleanolic acid)。同時，按其C-20位結(jié)構(gòu)的不同，又可分為20(S)-和20(R)-型，其中20(S)-構(gòu)型為人參中天然的人參皂苷構(gòu)型。大力參是將新鮮的人參經(jīng)沸水浸煮或汽燙后曬干而成，又稱為燙通參或燙參[4]。據(jù)研究表明，大力參具有降血脂和肝糖原等作用，其藥效“中和平穩(wěn)”，介于生曬參和紅參之間，但加工大力參對原料要求較高。目前，僅有少量研究[4-5]對大力參中的人參皂苷成分進行分析。本實驗利用高分離度快速液相色譜與四極桿-飛行時間質(zhì)譜(RRLC-Q-TOF MS/MS)聯(lián)用技術(shù)對生曬參和大力參中的人參皂苷類成分進行鑒別和對比分析，從化學(xué)角度闡釋了大力參區(qū)別于生曬參的物質(zhì)基礎(chǔ)，為探索大力參的質(zhì)量評價和臨床安全有效地使用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 1200型快速分離液相色譜系統(tǒng)，Agilent 6520 Q-TOF質(zhì)譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品。

人參皂苷Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Re和Rd等對照品(純度大于98%)：購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；乙腈為色譜純；其他試劑為分析純。

1.2 樣品溶液的制備

分別精密稱取1 g生曬參和大力參粉末，置于索氏提取器中，乙醚提取2 h，棄去乙醚液，再用甲醇浸泡過夜，提取3 h，蒸發(fā)皿中蒸干甲醇提取液，再用少量蒸餾水溶解后，用水飽和的正丁醇萃取4次，合并濃縮水飽和正丁醇層溶液，用色譜甲醇定容至10 mL，待測。

1.3 實驗條件

1.3.1液相色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱(2.1 mm×100 mm×3.5 μm)；梯度洗脫；流動相： 0.1%甲酸水溶液(A)，乙腈(B); 流動相梯度：0～3 min、25%～30%(B)，3～6 min、30%～32%(B)，6～7 min、32%～35%(B)，7～13 min、35%～37%(B)，13～19 min、37%～48%(B)，19～22 min、48%～90%(B)，22～25 min、90%(B)，30 min、25%B；柱溫30 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件 采用電噴霧負離子掃描模式(ESI-)，干燥氣(N2)流速9 L/min，干燥氣溫度 300 ℃，霧化氣壓力 2.41×105Pa，毛細管電壓為3.5 kV，碎裂電壓175 V，錐孔電壓65 V，質(zhì)量掃描范圍m/z100～2 000。實驗數(shù)據(jù)采用Masshunter Qualitative Analysis(B.03.01)軟件分析處理。

2 結(jié)果與分析

由于ESI是一種軟電離技術(shù)，在負離子模式下的一級質(zhì)譜圖中，其準分子離子主要以[M-H]-和[M+HCOOH-H]-的形式存在[6-7]。通過ESI和飛行時間質(zhì)譜分析可獲得皂苷類化合物的精確分子質(zhì)量信息。為了獲得更多的碎片離子結(jié)構(gòu)信息，需進行串聯(lián)分析，得到二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)采用提取離子流(EIC)方法進行分析。

分別對人參皂苷Rd、Re標準對照品進行質(zhì)譜分析，人參皂苷Rd和Re的理論分子質(zhì)量均為946.550 1，且元素組成一致，二者在一級質(zhì)譜圖中產(chǎn)生[M+HCOOH-H]-離子(理論值m/z991.548 3),其準分子離子峰的質(zhì)量數(shù)均為991，很難對兩者進行辨認和區(qū)分。但人參皂苷Rd和Re分別屬于二醇型人參皂苷和三醇型人參皂苷，分別對m/z991的分子離子進行串聯(lián)分析。人參皂苷Rd和Re在二級串聯(lián)質(zhì)譜條件下得到的質(zhì)譜圖示于圖1。

在圖1a中，觀察到分別丟失1-3分子中性葡萄糖(162 u)得到的碎片離子(Y0α/Y1β)m/z783、(Y1β)m/z621和(Y0β)m/z459，其中m/z459離子為二醇型人參皂苷的特征碎片離子[8]。在圖1b中，可以觀察到m/z945、799、783、637、475等碎片離子，推測分子離子m/z991連續(xù)脫去一分子甲酸、一分子146 u的脫氧六碳糖(鼠里糖 Rha)以及兩分子中性葡萄糖(162 u)，而m/z475離子是三醇型人參皂苷的特征碎片離子。

圖1 負離子模式下，人參皂苷Rd (a)和人參皂苷Re (b) 的MS/MS質(zhì)譜圖Fig.1 The MS/MS spectrum of ginsenoside Rd (a) and ginsenoside Re (b) in negative ion mode

丙二?；藚⒃碥誖d(mRd)為二醇型人參皂苷，其C-3位取代為一分子丙二?；蛢煞肿悠咸烟撬纬傻膫?cè)鏈，C-20位為一分子葡萄糖。丙二酰基人參皂苷mRd的二級串聯(lián)質(zhì)譜示于圖2。mRd理論分子質(zhì)量為1 032.550 5，在Q-TOF-MS一級譜圖中主要以[M-H]-離子的形式存在，[M-H]-理論值為1 031.543 2，測得值為1 031.543 8，誤差為0.58×10-6。從圖2中可以觀察到m/z945、927、783、765、621、459等碎片離子。其中，m/z1 031離子脫去丙二?；?86 u)產(chǎn)生了m/z945[M-malonyl-H]-特征碎片離子；脫去丙二?；退纬闪薽/z927離子；脫去1-3分子葡萄糖殘基以及水分子產(chǎn)生了m/z765、783、621、459碎片離子。

圖2 人參皂苷mRd的MS/MS質(zhì)譜圖Fig.2 The MS/MS spectrum of ginsenoside mRd

人參皂苷Rf和Rg1的理論分子質(zhì)量數(shù)均為800.492 2，在一級質(zhì)譜圖中均產(chǎn)生[M+HCOOH-H]-離子(理論值m/z845.490 4)。人參皂苷Rf和Rg1均為三醇型人參皂苷，其區(qū)別主要是C-6和C-20位取代的糖基側(cè)鏈不同。人參皂苷Rf的C-6位為兩分子葡萄糖殘基形成的糖基側(cè)鏈，而人參皂苷Rg1的C-6位和C-20位各有一分子葡萄糖殘基取代。人參皂苷Rg1(a)和人參皂苷Rf(b)的二級串聯(lián)質(zhì)譜圖示于圖3。從圖3a、3b中均可觀察到碎片離子m/z799、637、475。m/z799離子為人參皂苷Rf和Rg1的脫氫離子[M-H]-，隨即連續(xù)脫去兩分子葡萄糖生成碎片離子m/z637、475。但是，在圖3a中，碎片離子m/z637的相對豐度要明顯高于m/z475，而在圖3b中卻呈現(xiàn)出相反的現(xiàn)象。其原因可能是，由于人參皂苷Rg1的2個葡萄糖殘基分別連在不同的碳位上，即C-6和C-20，因此較易形成脫去一分子中性葡萄糖的m/z637離子。而人參皂苷Rf的兩分子葡萄糖殘基連在了同一個碳鏈上(C-6位)，因此更易形成脫去兩分子中性葡萄糖的m/z475碎片離子。

圖3 人參皂苷Rg1 (a)和人參皂苷Rf (b)的MS/MS質(zhì)譜圖Fig.3 The MS/MS spectrum of ginsenoside Rg1 (a) and ginsenoside Rf (b)

人參皂苷Rk3和Rh4的理論分子質(zhì)量為620.428 8，在質(zhì)譜中以[M+HCOOH-H]-形式存在，其理論值為665.427 0。大力參的提取離子流圖示于圖 4，可以觀察到，在17～19 min出現(xiàn)了人參皂苷Rk3和Rh4，而在生曬參的提取離子流圖中該保留時間并未出現(xiàn)化合物。

圖4 大力參的提取離子流圖 (m/z 665.427 0)Fig.4 The EIC spectrum of dali ginseng at m/z 665.427 0

通過與文獻數(shù)據(jù)[9-14]、標準對照品的比較，并根據(jù)高分辨Q-TOF-MS 獲得的精確分子質(zhì)量、MS/MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)，對大力參和生曬參中的人參皂苷進行鑒定和分析，根據(jù)峰面積來比較各人參皂苷的含量，結(jié)果列于表1。

從表1可以觀察到，在生曬參和大力參中，大多數(shù)的人參皂苷在含量上并無非常大的差異，尤其是mRb1、mRd等丙二?；藚⒃碥?。由于大力參的炮制過程中未經(jīng)過煎煮，因此大力參的皂苷類成分中還存在著天然的丙二?；惾藚⒃碥?。但是，大力參在炮制過程中仍會有一部分丙二?；惾藚⒃碥账饷撊チ吮；?，生成了相應(yīng)的人參皂苷，如 mRb2經(jīng)水解生成了Rb2，因此在大力參中像Rb2這樣相應(yīng)生成的人參皂苷的含量會有明顯的增加。此外，丙二?；惾藚⒃碥赵诖?lián)質(zhì)譜中會產(chǎn)生脫去丙二?；?86 u)的特征碎片離子[M-malonyl-H]-[15]?？梢钥闯?，只有少數(shù)的人參皂苷在含量上具有較大差異，如人參皂苷Rg3、Ro，并且在大力參中存在著一些生曬參中未檢測出的皂苷類成分，例如 F4、Rg6、Rg5、Rk1等。這是由于人參皂苷Re的C-20位糖基不穩(wěn)定，水解后生成了人參皂苷Rg2[16]，其C-20又進一步發(fā)生了脫水，生成了不飽和的人參皂苷F4與Rg6；人參皂苷Rb1、Rc、Rd、Rb2的C-20位糖基水解丟失生成了Rg3，同時Rg3又脫去了C-20位的羥基形成雙鍵，從而生成了人參皂苷Rk1與Rg5。而與生曬參相比較，存在于大力參中的這些含量、成分不同的人參皂苷，有些在紅參中也存在著相應(yīng)的變化[17-18]，如Rg3、Rg6、Ro。

表1 負離子模式下，35種人參皂苷的MS/MS數(shù)據(jù)Table 1 The MS/MS data of 35 kinds of ginsenosides in negative ion mode

續(xù)表

序號人參皂苷分子式WGDG[M-H]-/[M+HCOOH-H]-(m/z)質(zhì)量精確度<10-5MS/MS質(zhì)譜特征(m/z)17mRcC56H92O25+++++1163．5855/-1077，915，783，621，45918mRdC51H84O21++++++1031．5432/-945，783，765，621，45919Rg1C42H72O14++++++-/845．4904637，47520RfC42H72O14++++++799．4849/845．4904637，47521Rg2C42H72O13++++++783．49/829．4955637，47522ReC48H82O18++++++945．5428/-799，783，637，47523NotoR1C47H80O18+++++931．5272/977．5327799，637，47524NotoR2C41H70O13++++++769．4744/815．4798637，47525mRg1C45H74O17++++++885．4853/-781，637，47526mRfC45H74O17++++++885．4853/-781，619，47527mReC51H84O21++1031．5432/-945，799，637，4752820?Glc?RfC48H82O19++++++961．5378/1007．5432799，637，47529RoC48H76O19+++++955．4908/-793，613，569，45330F4/Rg6C42H70O12-+765．4795/811．4849619，45731F4/Rg6C42H70O12-+765．4795/811．4849619，45732Rg5/Rk1C42H70O12-+765．4795/811．4849603，44133Rg5/Rk1C42H70O12-+765．4795/811．4849603，44134RH4/Rk3C36H60O8-+-/665．42745735Rh4/Rk3C36H60O8-+-/665．427457

注：1.WG=White ginseng，DG=Dali ginseng；2.編號1～18為二醇型人參皂苷，編號19～28為三醇型人參皂苷，編號29為齊墩果烷型人參皂苷，編號30～35為其他類型人參皂苷；3.“-”代表未檢測到， “+”代表峰面積為 (0～3)×105， “++”代表峰面積為(3～10)×105， “+++”代表峰面積大于10×105

3 結(jié)論

本實驗利用LC-ESI-MSn技術(shù)對生曬參和大力參中的人參皂苷類成分進行了比較分析。研究表明，生曬參中主要的人參皂苷在大力參中均可找到，且多數(shù)人參皂苷含量相差不大，但大力參中含有一些在生曬參中未檢測到的人參皂苷，如人參皂苷F4、Rg6、Rg5、Rk1等。本工作建立了大力參中皂苷類成分的快速分析方法，為探索大力參的質(zhì)量評價和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

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