袁 琳，寧 丹，唐曦陽(yáng)，李 晶

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074)

常見的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法有比濁法、平板菌落計(jì)數(shù)法、血球板計(jì)數(shù)法等.比濁法和血球計(jì)數(shù)法均能較快的反應(yīng)細(xì)菌數(shù)，但不能判斷細(xì)菌的活性，易受培養(yǎng)基成分和代謝產(chǎn)物性質(zhì)等的影響[1-3].平板菌落計(jì)數(shù)法操作復(fù)雜、重復(fù)性差、耗時(shí)長(zhǎng)，不適于大批量實(shí)驗(yàn).

MTT 法簡(jiǎn)單、快速、靈敏、穩(wěn)定[4]，能準(zhǔn)確的反應(yīng)活細(xì)胞相對(duì)數(shù)目，目前已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)和腫瘤放射敏感性測(cè)定等[3, 5-7].MTT 比色法其檢測(cè)原理為利用活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶將外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)，并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能，二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，以甲臜生成量與活細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD 值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)[2,8,9].三羧酸循環(huán)中的琥珀酸脫氫酶在真核細(xì)胞中主要存在線粒體中，而在原核細(xì)胞中主要存在膜間，故MTT 法也可用來檢測(cè)活細(xì)菌數(shù)量[10].

金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)是重要的微生物研究材料，也是重要的食品污染指示菌.本實(shí)驗(yàn)以金黃色葡萄球菌為對(duì)象，探討MTT 法應(yīng)用于活細(xì)菌細(xì)胞數(shù)定量分析的可行性和檢測(cè)條件.

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

金黃色葡萄球菌(ACTT 25923)，由本室保存.胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉、紅霉素、MTT 等(Ameresco,美國(guó)).MH肉湯(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)，氯化鈉、二甲亞砜、無水乙醇為國(guó)產(chǎn)分析純.

酶標(biāo)儀(Multiskan ascent，Thermo Electron Corporation)，臺(tái)式恒溫振蕩器(THZ-B，江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)，潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH3600B，天津市泰斯特儀器有限公司).

1.2 菌種的活化

將保存在固體培養(yǎng)基上的金黃色葡萄球菌株接種于MH液體培養(yǎng)基中，于37℃，180 r/min過夜培養(yǎng)進(jìn)行初級(jí)活化.將活化好的初級(jí)菌種按2.5%的接種量進(jìn)行二級(jí)活化，于37℃，180 r/min繼續(xù)培養(yǎng) 6～8 h，使其達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.3 吸光度范圍的確定

將菌懸液用培養(yǎng)基倍比稀釋，于595 nm下直接測(cè)定各孔的吸光度，或加入MTT 溶液于37℃作用3 h后以DMSO溶解，于570 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度.設(shè)6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，下同.

1.4 DMSO 用量的對(duì)吸光度值的影響

將制備好的菌懸液加入96孔培養(yǎng)板中，MTT溶液作用3h 后，分別加入1～3倍菌液體積的DMSO，于570 nm下檢測(cè)不同用量DMSO 對(duì)吸光度值的影響.分別以培養(yǎng)基、菌懸液、菌懸液+ MTT、菌懸液+不同劑量的DMSO 為對(duì)照，于570 nm下測(cè)定各孔的吸光度.

1.5 MTT 作用濃度對(duì)吸光度值的影響

將制備好的菌懸液加入96 孔培養(yǎng)板中，分別加入濃度為0.05～1.0 mg/mL的MTT 溶液于 37 ℃下恒溫培養(yǎng)3 h后加入DMSO 200 μL，于570 nm下測(cè)定各孔的吸光度.

1.6 MTT 作用時(shí)間對(duì)吸光度值的影響

將制備好的菌懸液加入96 孔培養(yǎng)板中，加入MTT 溶液于37 ℃恒溫培養(yǎng)0.5～4 h后加入DMSO 200 μL，于570 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度.

1.7 MTT吸光度法與平板計(jì)數(shù)法的相關(guān)性

把培養(yǎng)好的金黃色葡萄球菌懸液進(jìn)行倍比稀釋為11個(gè)濃度梯度.以0.1 mL/孔均勻涂布接種于96 孔板中，以上述MTT法最適反應(yīng)條件測(cè)各孔吸光度值.同時(shí)以0.1 mL/皿均勻涂布于MH固體培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)各皿菌落數(shù)，建立菌液吸光度值與活菌數(shù)目的關(guān)系曲線.

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 吸光度范圍的確定

將培養(yǎng)好的金黃色葡萄球菌懸液接種于96 孔板，進(jìn)行倍比稀釋后，測(cè)定OD595，結(jié)果見圖1a.將與其平行的另一塊板加入MTT作用3 h后測(cè)定OD值(λ=570 nm，下同)，結(jié)果見圖1b. 由圖1可知，金黃色葡萄球菌懸液吸光度值隨著稀釋倍數(shù)的增加而逐漸下降.以濁度初步估計(jì)細(xì)菌的數(shù)量是可行的，但由于濁度值之間的差異很少，很容易受到其它因素的影響而干擾其結(jié)果準(zhǔn)確性(圖1a).用MTT 法檢測(cè)細(xì)菌數(shù)量或活力時(shí)，當(dāng)OD570在0.3～1.7時(shí)，隨著稀釋倍數(shù)的增加而呈線性下降趨勢(shì)(圖1b)，在此范圍內(nèi)OD570值與細(xì)菌數(shù)量呈正比. 為確保各次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)中所用菌液均調(diào)整濁度至OD595值在0.27±0.03范圍內(nèi).

圖1 不同稀釋倍數(shù)對(duì)吸光度值的影響Fig.1 The effect of different dilution ratio on the absorbance value

2.2 DMSO用量對(duì)吸光度值的影響

將菌懸液接種于96 孔板中并加入MTT 作用3 h后，加入不同量的DMSO 溶解，測(cè)得的吸光度值呈現(xiàn)出一定的變化趨勢(shì)，結(jié)果見圖2.如圖2所示，隨DMSO用量的增加，吸光度值呈上升趨勢(shì)，當(dāng)DMSO用量達(dá)菌液體積的2～2.5倍時(shí)基本達(dá)到峰值.考慮到96孔板每孔的容積，故本實(shí)驗(yàn)條件下確定DMSO 的最佳劑量為200 μL，即菌液體積的2倍.在此范圍內(nèi)，培養(yǎng)基、菌懸液、菌懸液+MTT、菌懸液+不同劑量的DMSO 所測(cè)吸光度值均約為0.2，對(duì)MTT法實(shí)驗(yàn)基本無影響.故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以菌懸液+ DMSO為對(duì)照.

V/μL圖2 不同體積的DMSO 對(duì)吸光度值的影響Fig.2 The effect of volumn of DMSO to the absorbance value

2.3 MTT 作用時(shí)間對(duì)吸光度值的影響

將菌懸液接種于96孔板中，加入MTT 溶液作用0.5～4 h后加入2倍體積的DMSO，于570 nm下測(cè)其吸光度.測(cè)得的吸光度呈現(xiàn)出一定的變化趨勢(shì)，結(jié)果如圖3所示.當(dāng)作用時(shí)間達(dá)2 h時(shí)吸光度值可達(dá)到峰值，故MTT最適作用時(shí)間為2 h.

t/h圖3 MTT 作用時(shí)間對(duì)吸光度的影響Fig.3 The effect of MTT reaction time to the absorbance value

2.4 MTT 濃度對(duì)吸光度值的影響

將菌懸液接種于96 孔培養(yǎng)板中，加入不同濃度的MTT 溶液，作用2 h 后加入2倍體積的DMSO，其吸光度值呈現(xiàn)典型的“鐘型”變化趨勢(shì)，結(jié)果見圖4.由圖4可見，當(dāng)MTT作用濃度為0.15～0.25 mg/mL時(shí)吸光度值達(dá)到峰值.為保證MTT的量足夠與菌液中琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，且在MTT 量充足的情況

下盡量降低MTT 毒性，在本實(shí)驗(yàn)條件中MTT的最適終濃度為0.25 mg/mL.

ρ/(mg·mL-1)圖4 MTT濃度量對(duì)吸光度值的影響Fig.4 Effects of the MTT concentration to the absorbance value

2.5 MTT吸光度法與平板菌落計(jì)數(shù)法的相關(guān)性

將MTT法所測(cè)的吸光度值與相對(duì)應(yīng)的活菌數(shù)目之間建立線性關(guān)系曲線，結(jié)果如圖5所示，活菌數(shù)目(菌落數(shù))在一定范圍內(nèi)與菌懸液的MTT吸光度值成線性相關(guān)，R2=0.9966,y=1008.9x-22.327.

D(λ) 圖5 吸光度值與平板菌落數(shù)目的關(guān)系Fig.5 The relationship between the absorbance value and the tablet colony numbers

3 討論

MTT能被活細(xì)胞線粒體中脫氫酶還原成藍(lán)細(xì)胞活性狀態(tài)色Formazan 顆粒，顆粒形成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比.細(xì)菌個(gè)體很小，通常在培養(yǎng)基中呈混懸狀生長(zhǎng)，低速離心很難將其從培養(yǎng)基中完全分離.而Formazan顆粒需要有機(jī)溶劑溶解，這可能是MTT法在細(xì)菌中很少使用的原因之一.

本文首先探討了在不去除上清的情況下，DMSO 對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)菌中Formazan顆粒的溶解情況，當(dāng)DMSO用量低于2倍菌液體積時(shí)，F(xiàn)ormazan顆粒不能完全溶解，吸光度值隨DMSO用量的增加而升高；而當(dāng)DMSO用量高于2.5倍菌液體積時(shí)，吸光度值則不再升高，說明Formazan顆粒

已完全溶解.因此，2～2.5倍菌液體積的DMSO為最適的溶解Formazan顆粒的實(shí)驗(yàn)條件.當(dāng)MTT作用時(shí)間達(dá)到并超過2 h后，其吸光度值即可達(dá)到峰值，這與細(xì)胞需要作用3～4 h不同，可能與兩者脫氫酶存在的部位不同及代謝活性有關(guān).

MTT對(duì)活的細(xì)菌具有毒性，當(dāng)MTT的終濃度小于0.15 mg/mL時(shí)，隨著MTT用量的增加吸光度值不斷增大；在0.15～0.25 mg/mL時(shí)，吸光度值維持在較高水平；但MTT濃度繼續(xù)增大則吸光度值呈持續(xù)下降，說明高濃度的MTT導(dǎo)致細(xì)菌活力下降甚至死亡.這可能是因?yàn)榇罅啃纬傻腇ormazan顆粒結(jié)晶對(duì)細(xì)菌形成機(jī)械損傷甚至破裂死亡.以有足量甚至過量的MTT與菌液中琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)確定最適MTT濃度為0.25 mg/mL.

當(dāng)細(xì)菌數(shù)在105～107個(gè)/mL時(shí)，MTT法所測(cè)的吸光度值與平板法所測(cè)的細(xì)菌活菌數(shù)量呈線性相關(guān)，R2>0.99，說明MTT法在一定范圍內(nèi)可準(zhǔn)確反映活菌數(shù)量.

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 王 栩, 鄔于川, 夏世平, 等. MTT法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)的方法學(xué)探討[J]. 瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2002, 25(4): 291-292.

[2] 汪志榮, 高 瓊, 馬傳鑫, 等. MTT法測(cè)定大腸桿菌活菌數(shù)實(shí)驗(yàn)研究[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 31(12): 2642-2650.

[3] 吳窈畫, 談書華, 范超超, 等. MTT法檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞數(shù)的主要影響因素分析[J]. 微生物學(xué)雜志, 2011, 31(3): 67-72.

[4] Sladowski D, Steer S J, Clothier R H, et al. An improved MTT assay[J]. J Immunol Methods, 1993, 157(1/2): 203-207.

[5] 向 麗, 朱 江, 曾 靜. 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)MTT法與常量稀釋法比較性研究[J]. 瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2006, 29(1): 45-46.

[6] 楊翠云, 劉永定. MTT方法評(píng)價(jià)微生物細(xì)胞活性的探討[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2009, 33(4): 577-580.

[7] Nuryastuti T, van der Mei H C, Busscher H J, et al. Eeffect of Cinnamon oil on icaA expression and biofilm formation by staphylococcus epidermidis[J]. Appl Environ Microbiol, 2009, 75(21): 6850-6855.

[8] 陳勝杰, 陳 歡, 胡凌俊, 等. MTT法在木醋桿菌活力檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(16): 8828-8829.

[9] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays[J]. J Immunol Methods, 1983, 65(1/2): 55-63.

[10] 高 偉, 唐益雄. 一種快速檢測(cè)細(xì)菌、真菌生長(zhǎng)及繁殖的方法[J]. 解剖學(xué)報(bào), 2002, 33(6): 656-658.