沈靜茹，張 祎，吳天驕，余學紅，柯雅莉

(1 中南民族大學 化學與材料科學學院分析化學國家民委重點實驗室；2 中南民族大學 校醫(yī)院，武漢 430074)

苯丙氨酸又稱α-氨基-β-苯丙酸(縮寫phe)，有一個手性碳(圖1)，一對對映異構(gòu)體.L-苯丙氨酸具有生物活性，是高血壓、心臟病、糖尿病人理想的甜味劑，還是合成抗病毒和抗癌藥物的原料；D-苯丙氨酸能增加人體的免疫功能，具有強的鎮(zhèn)痛作用，還可作為生產(chǎn)艾滋病毒抑制劑的藥物中間體，被廣泛應(yīng)用[1].高效毛細管電泳(HPCE)法成為商用儀器后[2]，因其分離效率高、分析時間短和樣品用量少等特點，大規(guī)模用于分離分析，特別是在手性化合物的分析測定方面[3,4].Zou Min等[5]使用HPCE儀，通過監(jiān)控溶質(zhì)的紫外吸收峰和計算擴散系數(shù)的效率關(guān)系，建立了測量苯丙氨酸含量的方法.Li Q等[6]在FITC熒光標注氨基酸后，用高速自動化HPCE系統(tǒng)檢測苯丙氨酸樣品.Yang BC等[7]也采用熒光標記樣品，HPCE分離檢測苯丙氨酸含量.Li Lian等[8]用加熱法制成均一穩(wěn)定的硅膠毛細管微柱，采用凝膠電泳技術(shù)分離苯丙氨酸，上述方法均只適用于外消旋體的含量測定.人工合成的苯丙氨酸多為外消旋體，傳統(tǒng)的拆分方法中，苯丙氨酸的分離大都通過手性衍生的間接方法[9].β-環(huán)糊精(β-CD)及其衍生物是常用的手性選擇劑[10-12],通過在β-CD支鏈上引入特定的結(jié)構(gòu)側(cè)鏈和官能團來提高手性分離能力.Li等[13]采用PLS最小二乘法結(jié)合紫外可見光譜測量苯丙氨酸對映體含量，該法將樣品衍生，通過化學計量法推算單一對映體的含量.近年來，有一些HPCE拆分苯丙氨酸的工作，如張春雨等[14]以DOCB-β-CD作為流動相手性添加劑，利用HPCE對氨基酸和手性藥物對映體進行拆分研究，D,L-苯丙氨酸達到基線分離，該法需消耗大量手性添加劑，且操作繁瑣.

本文利用自制的雙-(6-氧-間羧基苯磺?；?-β-CD(簡稱β-CD-M1)作為手性選擇劑，不僅保留了β-CD疏水空腔的立體選擇性，而且引入了羧基和苯磺?；功?CD衍生物具有良好的水溶性，將其作為固定相中單體，制備出性質(zhì)穩(wěn)定的HPCE有機整體柱，用于拆分苯丙氨酸，無需樣品柱前衍生，找到了最佳的分離條件，分離度Rs可達4.46.該方法為分離該対映異構(gòu)體及其單一對映體含量測定提供了一種HPCE整體柱拆分的新思路.同時，方法簡單、高效、低消耗，且符合綠色化學要求.

圖1 苯丙氨酸的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of phenylalanine

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

高效毛細管電泳儀(P/ACETMMDQ型, 美國BACKMAN)，酸度計(ZD-2型, 自動電位滴定儀，上海偉業(yè)儀器廠)，超聲波清洗器(KS-80D型,寧波科生儀器廠)，電子分析天平(FA2004型, 上海舜宇恒平科學儀器有限公司)，電磁攪拌器(7901型,上海華光儀器儀表廠)，融硅石英毛細管(75μm ID, 有效長度

55cm, 河北永年光纖廠)，微孔濾膜(0.22 μm,上海市新亞凈化儀器廠) .

三羥甲基氨基甲烷(Tris, 上海山浦化工有限公司)，磷酸(天津市科密歐化學試劑有限公司)，鹽酸(信陽市化學試劑廠)，D-苯丙氨酸(上海晶純試劑有限公司)，L-苯丙氨酸(武漢中合科技發(fā)展有限公司)， 超純水(美國 Moleculer 超純水機)， 雙-(6-氧-間羧基苯磺?；?-β-環(huán)糊精(按文獻[15]合成)，其他試劑均為分析純.

1.2 電泳條件

電泳柱：雙-(6-氧-間羧基苯磺酰基)-β-CD (β-CD-M1)制備的整體柱(參照文獻[16]制備)；流動相：Tris-H3PO4緩沖液， 按實驗需要配置成不同濃度和pH；所有溶液均經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾；設(shè)置好分離電壓和檢測波長，電泳整體柱每次運行前，用Tris-H3PO4緩沖液沖洗1h，采用壓力進樣；所有溶液均在室溫下配制.

2 結(jié)果與討論

2.1 緩沖液pH值對分離的影響

在β-CD-M1衍生物HPCE整體柱上，檢測波長選擇254 nm，工作電壓25 kV，6.2×10-3mol/L苯丙氨酸，進樣壓力0.5 psi，進樣時間10 s，柱溫25 ℃，緩沖液Tris-H3PO4的總濃度50 mmol/L的電泳條件下，改變緩沖液的pH值，依次為2.5、2.6、2.9、3.0、3.2、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、4.9、5.0，兩對映體拆分的HPCE結(jié)果如圖2所示.

a) pH 3.0；b) pH 3.2；c) pH 3.7；d) pH 4.6；e) pH 4.8；f) pH 5.0圖2 緩沖液pH對苯丙氨酸手性分離的影響Fig.2 Effect of the buffer pH on the separation of phenylalanine enantioseparation

酸度對分離度影響結(jié)果如圖3所示.由圖3可見，當pH≤3.0(pH 2.5～3.0)時，苯丙氨酸兩對映體無拆分跡象；隨著pH值的增大，苯丙氨酸對映體開始分離，且基線平穩(wěn).pH≥5.0時，也無法拆分苯丙氨酸對映異構(gòu)體.苯丙氨酸的等電點pI為5.48，緩沖液pH值的變化影響了苯丙氨酸兩對映體表面的帶電量，進而改變了兩對映體在電場中的遷移速度.當緩沖液的pH<5.48時，溶質(zhì)荷凈正電荷，僅在pH 3.4～4.8的環(huán)境下兩對映體帶電量差異較大，粒子遷移的總速度為電泳淌度和電滲流之和，在此酸度范圍內(nèi)整體柱有手性分離苯丙氨酸的能力.當pH為4.6時，苯丙氨酸對映體完全分離，分離度Rs值最大，前后峰對稱性良好，洗脫強度和基線均較理想.故選取pH4.6為緩沖液的最佳分離pH值，最佳分離酸度范圍為pH 3.4～4.8.

圖3 不同pH對苯丙氨酸分離度的影響Fig.3 Effect of different pH buffers on the separation of phenylalanine enantioseparation

2.2 緩沖液濃度對分離的影響

在β-CD-M1衍生物HPCE整體柱上，檢測波長選擇254 nm，工作電壓25 kV，6.2×10-3mol/L苯丙氨酸，進樣壓力0.5 psi，進樣時間10 s，柱溫25 ℃，pH 4.6緩沖液Tris-H3PO4的電泳條件下，改變緩沖液Tris-H3PO4的濃度分別為20,30,40, 50, 60 mmol/L，分離結(jié)果如圖4所示.

a) 40 mm/L；b) 50 mm/L；c) 60 mm/L圖4 緩沖液濃度對苯丙氨酸手性分離的影響Fig.4 Effect of the buffer concentration on the separation of phenylalanine enantioseparation

上述條件下分離度數(shù)據(jù)如表1.由表1可見，隨著緩沖液濃度的增大，溶液粘度增大，電滲流降低，苯丙氨酸在毛細管內(nèi)的遷移時間延長.在2.2實驗條件考察中，當緩沖液濃度高于60 mmol/L，后峰的出峰時間在60 min之后，實際分析中不適用；當濃度低于30 mmol/L的情況時，兩峰部分重疊，未達到基線分離.故緩沖液濃度為50 mmol/L為最佳分離濃度，此時緩沖液對苯丙氨酸兩對映體的洗脫強度適宜，分析時間和分離度適中，基線平穩(wěn)，對映體達到完全分離.

表1 不同緩沖液濃度對苯丙氨酸對映體分離的影響

2.3 不同電壓對分離的影響

在β-CD-M1衍生物HPCE整體柱上，檢測波長選擇254 nm，6.2×10-3mol/L苯丙氨酸，進樣壓力0.5 psi，進樣時間10 s，柱溫25 ℃，緩沖液Tris-H3PO450 mol/L，pH 4.6的電泳條件下，分別考察電壓為23、25、28 kV時苯丙氨酸的分離情況，如圖5所示.由圖5可見，電壓為25 kV時基線平穩(wěn)，分析時間適當，分離度大.故最佳分離電壓為25 kV.

a ) 23 kV；b) 25 kV；c) 28 kV圖5 電壓對苯丙氨酸對映體分離的影響Fig.5 Effect of voltages on the separation of phenylalanine enantioseparation

2.4 方法評價

2.4.1 苯丙氨酸對映體拆分的線性范圍

在β-CD-M1為單體制備的手性HPCE整體柱上，Tris-H3PO4緩沖液50 mmol/L，pH 4.6，進樣0.5 psi，10 s，分離電壓25 kV，檢測波長254 nm，柱溫25 ℃，用濃度為2.1×10-3～1.0509×10-2mol/L苯丙氨酸標準品水溶液，考察苯丙氨酸的線性范圍，L-苯丙氨酸峰高-濃度線性關(guān)系為y=4.55×102+3.12×105x，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9916；峰面積-濃度線性關(guān)系為y=5.25×103+5.00×106x，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9942；D-苯丙氨酸峰高-濃度線性關(guān)系為y= 4.68×102+1.24×104x，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9952；峰面積-濃度線性關(guān)系為y=1.29×104+1.42×106x，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9341.由此初步確定，若以峰高為定量參數(shù)可定量測定苯丙氨酸兩對映體的含量，若以峰面積為定量參數(shù)則只能對L-苯丙氨酸進行定量測定.

2.4.2對比實驗

在HPCE最佳分離條件下，用純水作對照實驗，進純水樣時基線平穩(wěn)，排除了樣品配置中水溶液在同一分離條件下的影響.分別在β-CD-M1衍生物HPCE整體柱和空毛細管電泳柱中對比了拆分苯丙氨酸兩對映體的分離情況.在空毛細管電泳柱上用同樣的Tris-H3PO4緩沖液，無法洗脫苯丙氨酸兩對映體，如圖6曲線b所示，而該緩沖液在β-CD-M1衍生物HPCE整體柱上，在最佳分離條件下，不僅對兩對映體有較強的洗脫能力，還有較好的拆分效果，如圖6曲線a所示，D,L苯丙氨酸兩對映體分離度可達到4.46.

3 結(jié)語

制備了β-CD-M1手性HPCE整體柱，將其用于拆分D,L-苯丙氨酸，考察了緩沖液的酸度、濃度和分離電壓等條件對分離的影響，對比了空柱的分離效果，建立了新的高效毛細管電泳手性整體柱拆分無衍生化苯丙氨酸的方法.結(jié)果表明：通過對β-CD改性，用間羧基苯磺酰基修飾后，彌補了β-CD自身的不足.苯丙氨酸結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)能在β-CD衍生物的腔體內(nèi)產(chǎn)生包合作用，與衍生物上的苯環(huán)也可產(chǎn)生π-π共軛作用，同時，樣品中存在的羧基、氨基基團能與衍生物中的羥基、羧基等極性基團產(chǎn)生相互誘導的極化作用，使苯丙氨酸對映異構(gòu)體在適宜的條件下達到完全分離.實驗結(jié)果重現(xiàn)性好，在pH 4.6， 50 mmol/L的Tris- H3PO4緩沖液中進樣0.5 psi、10 s，工作電壓25 kV，檢測波長254 nm條件下，D,L苯丙氨酸兩對映體得到基線分離，分離度Rs達到4.46.

a)整體柱；b)空柱圖6 苯丙氨酸對映體在不同毛細管柱下的分離Fig.6 The separation of phenylalanine enantioseparation with different column

參 考 文 獻

[1] Pogson C I, Knowles R G, Salter M. The control of aromatic amino acid catabolism and its relationship to neurotransmitter amine synthesis[J]. Crit Rev Neurobiol, 1989, 5(1): 29-64.

[2] Cemil Aydogan, Fatma Yilmaz, Duygu Cimen, et al. Enantioseparation of aromatic amino acids using CEC monolith with novel chiral selector, N-methacryloyl- L -histidine methyl ester[J]. Electrophoresis, 2013, 34(13): 1908-1914.

[3] Allen D, Rassi Z E. Silica-based monoliths for capillary electrochromatography: methods of fabrication and their applications in analytical separations[J]. Electrophoresis, 2003, 24(22/23): 3962-3976.

[4] Weinberger R. Practical capillary electrophoresis[M]. Academic Press: Amsterdam, 2000.

[5] Zou M,Han Y L, Qi L,et al.Fast and accurate measurement of diffusion coefficient by Taylor′s dispersion analysis[J]. Chin Sci Bull, 2007, 52(24):3325-3332．

[6] Li Q, Zhang T, Zhu Y Q, et al. Automated high-speed CE system for multiple samples[J]. Electrophoresis, 2013, 34(4): 557-561.

[7] Yang B C, Tan F, Guan Y F. A laser diode double-pumped solid-state laser-induced fluorescence detector for capillary electrophoresisand liquid chromatography[J]. LCGC North America, 2005, 23(10): 1100-1112.

[8] Li L, He Y Z, Gan W E, et al. Electrophoretic separa-tion with 2-mm inner diameter fused-silica microcolumn packed with quartz microncrystals and its application[J]. Talanta, 2009, 79(2): 460-465.

[9] István Ilisz, Anita Aranyi, Antal Péter. Chiral derivati-zations applied for the separation of unusual amino acid enantiomers by liquid chromatography and related techniques[J]. J Chromatogr A, 2013, 1296(28):119-139.

[10] Reijenga J C, Ingelse B A, Everaerts F M. Thermody-namics of chiral selectivity in capillary electrophoresis: separation of ibuprofen enantiomers withβ-cyclodextrin[J].J Chromatogr A, 1997, 792(1/2) : 371-378.

[11] Wang H S, Jiang P, Zhang M, et al. Synthesis of a novel restriacted access chiral stationary phase based on atom transfer radical polymerization and click chemistry for the analysis of chiral drugs in biological matrices[J].J Chromatogr A, 2011, 1218(9): 1310-1313.

[12] Tian Y, Zhong C, Fu E, et al. Novel beta-cyclodextrin derivative functionalized polymethacrylate-based monolithic columns for enantioselective separation of ibuprofen and naproxen enantiomers in capillary electrochromatography[J]. J Chromatogr A, 2009, 1216(6): 1000-1007.

[13] Li Q, Duan J, WU L J, et al. Sucrose as chiral selector for determining enantiomeric composition of phenyla-lanine by UV-vis spectroscopy and chemometrics[J]. Chin Chem Lett, 2012, 23(9): 1055-1058.

[14] 張春雨, 李英杰, 郝秀菊,等. 毛細管電泳法手性拆分4種氨基酸和2種手性藥物對映體[J]. 應(yīng)用化學, 2011, 28(11): 1055-1058.

[15] 丁志剛, 劉學群, 詹國慶, 等.β-CD與間羧基苯磺酰氯及Fe3+構(gòu)筑氧化還原酶[J]. 化學學報, 1995, 53(6): 578-582.

[16] 蔡 薇. 雙-(6-氧間羧基苯磺?；?-β-環(huán)糊精HPCE整體柱拆分手性藥物[D]. 武漢: 中南民族大學, 2013.