高風坤，陸 蕾，張文婧，程才紅，侯文龍，楊越冬

(河北科技師范學院河北省天然產(chǎn)物活性成分與功能重點實驗室，河北 秦皇島，066004)

殼聚糖的分子量相對較大，小到數(shù)萬大到數(shù)百萬不等，獨特的結(jié)構(gòu)和較大的分子量使得其溶解性較差，在水中不溶解，可以溶解于弱酸，在很大程度上限制了它的應用[1,2]。

提高殼聚糖溶解性的方法之一是通過增加親水性官能團來修飾分子結(jié)構(gòu)。殼聚糖含有多個羥基(C-6上的伯羥基和C-3上的仲羥基)和高活性(C-2)氨基[3]，可通過不同的方法進行修飾。國內(nèi)外研究者已對殼聚糖的氧化進行了大量的探究。Coseri等[4]研究表明，氮氧自由基2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPO)催化氧化還原體系可以氧化脂肪族和芳香族醇，是一種有效的催化體系。Bragd P等[5]使用TEMPO/NaClO/NaBr氧化體系將殼聚糖C-6位氧化，但由于鹵化試劑(NaClO和NaBr)和有機溶劑的使用，會對環(huán)境造成一定的污染。使用TEMPO-漆酶來氧化殼聚糖是對TEMPO氧化體系的很好的補充[6]。TEMPO-漆酶可用于促進殼聚糖的區(qū)域選擇性氧化，以生產(chǎn)具有新的生物活性的定制衍生物[7]。但是TEMPO只能溶于有機溶劑，對氧化的底物有一定要求，體系氧化度不高，氧化醇到羧酸比較困難，大多氧化為醛或者酮。Whistler等[8]使用N2O4作為氧化劑，將固體N2O4揮發(fā)成氣體后隔濕氧化殼聚糖，測得氧化度不理想，且發(fā)生了主鏈降解及部分氧化脫氨。Horton等[9]采用CrO3作為氧化劑，先將醇羥基氧化成醛基，然后加水使醛基氧化為羧基，最后滴加NaOH溶液，使得C-6羧基形成鈉鹽形式，但其配位吸附的Cr3+很難除凈。

本次研究擬使用NO2作為氧化劑來氧化不同分子量的殼聚糖，研究不同分子量對其被氧化程度的影響，通過對殼聚糖進行氧化來解決殼聚糖溶解性較差且難以應用的問題，并對氧化后得到的6-羧基殼聚糖在不同溶劑中的溶解性進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

50，200，1 000 ku分子量殼聚糖引自濟南海得貝海洋生物工程有限公司；冰乙酸(優(yōu)級純)、無水乙醇(分析純)、銅片(分析純)、硝酸(分析純)、甲醛(分析純)、乙酸乙酯(分析純)、苯(分析純)、吡啶(分析純)、二氯甲烷(分析純)、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)、二甲基亞砜(分析純)、NaOH(分析純)均購自天津歐博凱化工有限公司。

1.2 制備方法

1.2.1NO2氣體的制備通過銅片與濃硝酸反應來制備NO2，將制備的NO2氣體用向上排空氣法收集到廣口瓶中，將尾氣通入到NaOH溶液中。

1.2.2 6-羧基殼聚糖的制備將3種不同分子量的殼聚糖分別浸泡在冰乙酸中充分接觸2 h，然后將制得的NO2氣體通入到裝有磁力攪拌的反應裝置中。在10 h內(nèi)勻速的通入16氣瓶NO2氣體，停止通氣反應一夜，再通入16氣瓶NO2氣體，停止通氣后繼續(xù)反應一夜，整個反應過程中盡量隔絕水氣。向裝置中加入同體積的無水乙醇，充分攪拌，抽濾，再用無水乙醇洗滌3次。干燥得到3種不同分子量的6-羧基殼聚糖(圖1)。

圖1 NO2氧化殼聚糖原理

1.3 表征手段

利用傅立葉變換紅外光譜儀(德國布魯克公司生產(chǎn)，TENSOR 27)對樣品分子結(jié)構(gòu)和化學組成進行分析；使用差熱熱重同步分析儀(德國耐馳公司生產(chǎn)，STA 4094 PC)測定樣品的熱穩(wěn)定性；使用場發(fā)射掃描電鏡(日本日立公司生產(chǎn)，SU8010)對樣品形貌進行觀察；使用X射線衍射儀(日本理學公司生產(chǎn)，D/max-2500PC)對樣品進行物相分析。

1.4 氧化度測定

根據(jù)公式(1)對6-羧基殼聚糖的氧化度(DO)進行測定[10,11]。

(1)

式中：c，v分別是NaOH標準溶液的濃度(mol/L)和體積(mL)。

m為樣品中殼聚糖分子鏈上羥甲基(—CH2OH)被氧化成羧基(—COOH)的單元數(shù)(mol)。

(2)

式中：DO為氧化度，w為樣品質(zhì)量，X為原料殼聚糖脫乙酰度。

1.5 溶解性

將乙酸乙酯，乙醇，甲醇，二氯甲烷，苯，水，DMSO，DMF，0.3 mol/L NaOH溶液，0.2 mol/L稀乙酸溶液，吡啶各取3 mL分別倒進裝有10 mg 6-羧基殼聚糖的玻璃小瓶中，溶解24 h，觀察6-羧基殼聚糖在各個溶劑中的溶解性。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化度

測定結(jié)果表明，50 ku分子量6-羧基殼聚糖氧化度為33.18%；200 ku分子量6-羧基殼聚糖氧化度為39.94%；1 000 ku分子量6-羧基殼聚糖氧化度為54.54%。在相同的制備條件下，氧化度隨著殼聚糖分子量的增大而升高，說明殼聚糖的分子量越高越容易被氧化。

2.2 紅外光譜分析

2.2.1殼聚糖3種不同分子量的殼聚糖的紅外光譜分析結(jié)果表明，殼聚糖的特征伸縮振動吸收峰位置都與文獻[12]一致(圖2)。在3 427.44 cm-1處的強而寬的峰為O—H和N—H的伸縮振動吸收峰；在2 872.26 cm-1和2 918.54 cm-1處的峰為—CH對稱伸縮振動吸收峰和—CH2不對稱伸縮振動吸收峰；在1 649.10 cm-1處為酰胺Ⅰ帶吸收峰；在1 598.95 cm-1處為殼聚糖分子中—NH2的面內(nèi)彎曲振動吸收峰；1 421.51 cm-1處吸收峰為—CH2彎曲和—CH3變形振動吸收峰；1 381.08 cm-1處為—CH彎曲振動和對稱變形振動吸收峰；在1 155.33 cm-1處的吸收峰為吡喃環(huán)中不對稱氧橋伸縮振動；在1 078.19 cm-1附近的二級羥基C—O伸縮、1 031.89 cm-1處的一級羥基的C—O伸縮和氨基的C—N伸縮振動吸收峰重疊，在1 000～1 100 cm-1范圍內(nèi)形成較強較寬的吸收峰；896.88 cm-1處的伸縮振動吸收峰為β-吡喃糖苷的特征吸收峰。在1 649.10 cm-1與1 598.95 cm-1處的吸收峰強弱可初步判斷殼聚糖分子的脫乙酰度，后者峰強相比前者越大，表明殼聚糖分子脫乙酰度越高。

圖2 殼聚糖的紅外光譜a，50 ku分子量殼聚糖；b，200 ku分子量殼聚糖；c，1 000 ku分子量殼聚糖

2.2.2 6-羧基殼聚糖3種6-羧基殼聚糖的紅外光譜結(jié)果表明，3種殼聚糖都成功被氧化(圖3)。在1 031.89 cm-1處吸收峰強度明顯減弱，說明C-6上的醇羥基被氧化；在1 726.25 cm-1處出現(xiàn)羧基的伸縮振動吸收峰，說明醇羥基被氧化為羧基。3種不同分子量的殼聚糖都成功被氧化為6-羧基殼聚糖，且隨著殼聚糖分子量的增大，羧基的吸收峰也越來越強，說明6-羧基殼聚糖的氧化率隨著分子量的增大而提升，此結(jié)論與氧化度測定結(jié)果吻合。

圖3 6-羧基殼聚糖的紅外光譜a，50 ku分子量6-羧基殼聚糖；b，200 ku分子量6-羧基殼聚糖；c，1 000 ku分子量6-羧基殼聚糖

2.3 熱穩(wěn)定性

2.3.1殼聚糖不同分子量殼聚糖在氮氣氣氛下，流量為30 mL/min，Al2O3坩堝，升溫速率10 K/min，溫度范圍為20～800 ℃的熱重分析 (TG)圖譜表明，3種不同分子量殼聚糖的熱分解為兩個階段(圖4)，且分解溫度基本相同。第一個分解階段出現(xiàn)在80 ～110 ℃，主要是脫去部分水分，分子量大的殼聚糖失去質(zhì)量較少；第二個分解階段始于280 ℃左右，在500 ℃后，殼聚糖的質(zhì)量趨于穩(wěn)定。且分子量越大的殼聚糖分解的溫度越高。50 ku分子量殼聚糖在284.2 ℃時開始分解，200 ku分子量殼聚糖在286.5 ℃時開始分解，1 000 ku分子量殼聚糖在287.0 ℃時開始分解。這一階段為殼聚糖自身的熱降解，包括殼聚糖的糖環(huán)的脫水，聚合物單元的解聚。

2.3.2 6-羧基殼聚糖比較3種不同分子量6-羧基殼聚糖的TG圖譜和殼聚糖的TG圖譜可以得出結(jié)論，殼聚糖比6-羧基殼聚糖熱穩(wěn)定性更好(圖4，圖5)。殼聚糖在結(jié)束熱分解第一階段的脫水后隨著溫度升高質(zhì)量保持不變，說明分子內(nèi)化學鍵更穩(wěn)定；而6-羧基殼聚糖在失水后聚合物單元也開始斷裂，糖環(huán)脫水，這是由于將殼聚糖C-6位醇羥基氧化為羧基破壞了殼聚糖原有的分子間的氫鍵。3種不同分子量的6-羧基殼聚糖的熱穩(wěn)定性相差不大，隨著分子量增大，氧化度的提升對6-羧基殼聚糖的熱穩(wěn)定性也有影響(圖5)。在熱分解第二階段，氧化度越高失去質(zhì)量越迅速。由于氧化度升高導致氧含量升高，最終煅燒后剩余的殘余質(zhì)量隨著氧化度的升高而減小。

圖4 殼聚糖的TG圖譜a，50 ku分子量殼聚糖；b，200 ku分子量殼聚糖；c，1 000 ku分子量殼聚糖圖5 6-羧基殼聚糖的TG圖譜a，50 ku分子量6-羧基殼聚糖；b，200 ku分子量 6-羧基殼聚糖；c，1 000 ku分子量6-羧基殼聚糖

2.4 物相分析

X射線衍射結(jié)果表明，3種殼聚糖的衍射峰位置重合(圖5中的a，c，e曲線)。由于殼聚糖為低結(jié)晶性高分子，在2θ為20.38°處觀察到的衍射峰為殼聚糖的非晶態(tài)聚合峰，與文獻[12]中殼聚糖的特征衍射峰位置吻合。而3種6-羧基殼聚糖的衍射峰位置與殼聚糖基本一致(圖5中的b，d，f曲線)，說明對殼聚糖C-6位進行羧基化并不會改變殼聚糖的晶型，分子鏈的規(guī)整性還保持完好，沒有受到破壞。

2.5 形貌分析

在同一尺寸下觀察3種不同分子量殼聚糖及其氧化物6-羧基殼聚糖的形貌，SEM形貌分析表明，殼聚糖形貌為多層紙片型結(jié)構(gòu)重疊在一起的片層狀結(jié)構(gòu)，且表面粗糙，凹凸不平(圖7)。殼聚糖的寬度在幾十微米到100多微米，厚度為幾微米；由于本反應屬于非均相反應，反應前后對殼聚糖形貌未發(fā)生較大變化，6-羧基殼聚糖的形貌與殼聚糖基本相似，表面較殼聚糖更為粗糙。

圖6 殼聚糖和6-羧基殼聚糖的XRD圖譜50 ku分子量:a 殼聚糖，b 6-羧基殼聚糖；200 ku分子量：c 殼聚糖，d 6-羧基殼聚糖；1 000 ku分子量：e 殼聚糖，f 6-羧基殼聚糖

圖7 殼聚糖及其衍生物的FESEM結(jié)果50 ku分子量：(a)殼聚糖，(d)6-羧基殼聚糖；200 ku分子量：(b)殼聚糖，(e)6-羧基殼聚糖；1 000 ku分子量：(c)殼聚糖，(f)6-羧基殼聚糖

2.6 溶解性

溶解性測試結(jié)果表明，分子量越大，6-羧基殼聚糖的溶解性越好。圖8中的A，B，C分別為50，200，1 000 ku分子量6-羧基殼聚糖在不同溶劑中的溶解情況?？梢钥闯觯》肿恿繗ぞ厶侨芤旱念伾S；而大分子量殼聚糖溶液的顏色呈白色，氧化反應未改變產(chǎn)物顏色。6-羧基殼聚糖在水和稀乙酸溶液中溶解性最強，6-羧基殼聚糖完全溶解，在DMSO中大部分溶解，其次在苯、吡啶和氫氧化鈉溶液中部分溶解，在其他溶劑中未溶解。對比不同分子量6-羧基殼聚糖在同一溶劑中的溶解情況，可以看到分子量越高在溶劑中的溶解性越好，這一結(jié)果正好和測得的6-羧基殼聚糖的氧化度結(jié)果相對應，6-羧基殼聚糖的氧化度越高，其在溶劑中溶解的越多，溶解性越好。

圖8 3種6-羧基殼聚糖在不同溶劑中的溶解性A行，50 ku分子量6-羧基殼聚糖；B行，200 ku分子量6-羧基殼聚糖；C行，1 000 ku分子量6-羧基殼聚糖

3 結(jié) 論

本次試驗使用NO2作為氧化劑來氧化3種不同分子量的殼聚糖制備6-羧基殼聚糖。通過XRD，SEM，F(xiàn)TIR，熱重分析對殼聚糖和6-羧基殼聚糖進行了表征，測試其氧化度以及對其在不同溶劑中的溶解情況進行初步試驗。試驗結(jié)果表明：(1)使用NO2氧化法成功將殼聚糖的C-6位的醇羥基氧化為羧基，并制備出3種不同分子量6-羧基殼聚糖。(2)引入羧基使得6-羧基殼聚糖熱穩(wěn)定性變差但并未改變殼聚糖晶體晶型。(3)殼聚糖分子量越大氧化效果越好，1 000 ku分子量6-羧基殼聚糖的氧化度為54.54%，(4)3種不同分子量6-羧基殼聚糖在水和稀乙酸溶液中完全溶解，在DMSO中大部分溶解，其次在苯、吡啶和氫氧化鈉溶液中部分溶解，在其他溶劑中未溶解。