陳 雪，孫婧霞，曹翠麗，蔣常文

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種多發(fā)于老年人，病理改變主要發(fā)生在大腦皮質(zhì)和海馬，以 β 淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)沉積形成老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)、神經(jīng)元丟失為主要病理特征。目前普遍認(rèn)同AD的主要發(fā)病機(jī)制:具有神經(jīng)毒性的Aβ在腦實(shí)質(zhì)沉積，啟動(dòng)病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)，形成NFT，導(dǎo)致廣泛的神經(jīng)元丟失［1］。Aβ是由39～43個(gè)氨基酸構(gòu)成，其中，Aβ1-42肽具有較高聚集傾向，是老年斑中最主要的淀粉樣物質(zhì)［2－3］，而且，Aβ1-42 可能參與了突觸改變、細(xì)胞凋亡以及由輕度認(rèn)知功能障礙發(fā)展到AD的進(jìn)程［4］。目前，轉(zhuǎn)基因AD動(dòng)物模型是研究 AD的一大熱點(diǎn)，但該模型缺少衰老過(guò)程，不能完全復(fù)制人類AD的所有特征，而且操作技術(shù)復(fù)雜，費(fèi)用昂貴，因此還不能廣泛應(yīng)用。該研究模擬Aβ沉積，將Aβ1-42少量多次灌注于大鼠側(cè)腦室制備AD模型，利用Morris水迷宮法觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改變，用RT-PCR法和Western blot法檢測(cè)大鼠皮質(zhì)Bcl-2、Caspase-3的 mRNA表達(dá)以及 Bcl-2蛋白表達(dá)、Caspase-3活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠65只，SPF級(jí)，250～300 g，2～3月齡，由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 試劑 Aβ1-42和六氟異丙醇(美國(guó)Sigma公司);mRNA提取試劑盒和PCR反應(yīng)體系(北京艾德萊公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和引物(Invitrogen公司);DNA Marker(廣州東盛生物科技有限公司);WIP組織裂解液(北京博奧森公司);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天公司);兔抗Caspase-3(Active)一抗(上海藍(lán)基公司);兔抗Bcl-2一抗 (武漢博士德公司);鼠抗β-actin一抗、山羊抗小鼠IgG二抗、山羊抗兔IgG二抗、ECL發(fā)光液(北京中杉金橋公司);PageRulerTM預(yù)染蛋白梯度(上海麥約爾公司);微量給藥系統(tǒng)(深圳瑞沃德公司);實(shí)驗(yàn)所需的儀器由桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心和解剖教研室提供。

1.2 方法

1.2.1 Aβ1-42寡聚體和 Aβ1-42纖維的制備 ①Aβ1-42寡聚體制備:將1 mg Aβ1-42單體溶于六氟異丙醇至濃度為4.5 mg/ml，室溫孵育60 min，真空冷凍蒸發(fā)六氟異丙醇后，加入二甲基亞砜至濃度為22.5 mg/ml，超聲浴處理10 min，加入含有0.2%SDS的PBS，稀釋濃度至2.5 mg/ml，4℃孵育24 h后，用PBS稀釋至終濃度1 mg/ml，4℃孵育2周。② Aβ1-42纖維的制備:Aβ1-42溶于PBS中，濃度為1 mg/ml，37℃孵育7 d，轉(zhuǎn)變?yōu)榫奂瘧B(tài)的 Aβ1-42，4 ℃保存。

1.2.2 AD動(dòng)物模型的制備 通過(guò)Morris水迷宮試驗(yàn)，將逃避潛伏期少于60 s的健康雄性SD大鼠60只隨機(jī)分成4組(n=15):正常組、PBS對(duì)照組、Aβ1-42纖維組、Aβ1-42寡聚體組。用10%水合氯醛(300～350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，頭頂部備皮。將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上，手術(shù)區(qū)消毒，在顱頂中間部作一縱切口，暴露顱骨，參照《大鼠腦立體定位圖譜》，前囟后0.8 mm，中線旁開(kāi)1.5 mm，用牙科鉆鉆開(kāi)顱骨，垂直插入微量給藥導(dǎo)管(長(zhǎng)度3.5 mm)，用牙托粉和義齒基托樹(shù)膠將給藥導(dǎo)管固定于顱骨表面，縫合皮膚，肌肉注射青霉素8萬(wàn)單位/只，預(yù)防感染。通過(guò)微量注射內(nèi)管，每天給予Aβ1-42纖維或Aβ1-42寡聚體 5 μg，連續(xù)給藥5 d。PBS對(duì)照組采用同樣的方法給予等量的PBS，正常組不作任何處理。

1.2.3 Morris水迷宮測(cè)試大鼠行為學(xué)習(xí)記憶能力的變化 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)包括一不銹鋼圓形水池、一可調(diào)換位置的圓形透明的有機(jī)玻璃平臺(tái)，電腦以及連接電腦的攝像機(jī)。Morris水迷宮圓形水池等分為4個(gè)象限，平臺(tái)置于第4象限中央位置，平臺(tái)低于水面2 cm。在各象限中間標(biāo)記入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁分別從3個(gè)入水點(diǎn)(不包括第4象限入水點(diǎn))放入水中，若大鼠入水后60 s未能找到平臺(tái)，則把大鼠從水中拖上平臺(tái)，并停留10 s，接著進(jìn)行下一次訓(xùn)練。每組大鼠在造模前均進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，從訓(xùn)練的第3天開(kāi)始，記錄大鼠從入水尋找并爬上平臺(tái)所需要的時(shí)間(即逃避潛伏期)，連續(xù)測(cè)試5 d，每天測(cè)試2次，兩次平均值為當(dāng)天逃避潛伏期。造模結(jié)束后的第4周采用同樣的方法對(duì)大鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，連續(xù)測(cè)試5 d，每天2次。根據(jù)每組大鼠造模前后逃避潛伏期的長(zhǎng)短判斷各組大鼠記憶能力的變化情況。水迷宮實(shí)驗(yàn)環(huán)境安靜，周圍參照物不變，室內(nèi)日光燈照明，水溫25℃，時(shí)間一般選在10∶00～12 ∶00，15 ∶00 ～17 ∶00。

1.2.4 RT-PCR法檢測(cè)AD大鼠皮質(zhì)Bcl-2 mRNA、Caspase-3 mRNA的表達(dá) PCR反應(yīng)體系(參考PCR說(shuō)明書):Taq Master Mix 12.5 μl，上下游引物各 1 μl(10 μm)，模板 DNA 4 μg，加 DEPC 水補(bǔ)至25 μl。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃ 2 min，變性94℃ 30 s、退火50～60℃ 30 s、延伸72℃ 1 min(30個(gè)循環(huán))，終延伸72℃ 5 min。Bcl-2引物序列:上游為5'-GCCTTCTTTGAGTTCGGT-3'，下 游 為 5'-TCAAACAGAGGTCGCAT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)188 bp;Caspase-3引物序列:上游為 5'-CAGAGCTGGACTGCGGTATT-3'，下 游為 5'-CCATGACCCGTCCCTTGAAT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)146 bp;β-actin引物序列:上游為 5'-CCTTCTTGCAGCTCCTCCGTC-3'，下游為 5'-TCTCCATATCGTCCCAGTTGGTG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)299 bp。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用LeicaQ5100W型全自動(dòng)圖像分析儀分析電泳結(jié)果。

1.2.5 Western blot檢測(cè) AD大鼠皮質(zhì) Bcl-2蛋白表達(dá)及Caspase-3活性 造模后水迷宮試驗(yàn)后，從各組中隨機(jī)選取5只大鼠斷頭取腦，分離皮質(zhì)，依照WIP組織細(xì)胞裂解液說(shuō)明書提取蛋白，用BCA法檢測(cè)樣本蛋白濃度。樣品的上樣體積為30 μl(總蛋白量為30 μg)，用12%的凝膠進(jìn)行 SDS-PAGE電泳;轉(zhuǎn)膜后以5%的脫脂奶封閉液封閉;一抗(1∶300)孵育2 h;用TBST洗膜3次(10 min/次);加入二抗(1∶6 000)孵育1 h;洗膜。用Western blot發(fā)光試劑盒發(fā)光、顯影、定影。用全自動(dòng)數(shù)碼成像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)記憶能力的變化(逃避潛伏期)造模前各組大鼠的逃避潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模后，Aβ1-42纖維組、Aβ1-42寡聚體組大鼠逃避潛伏期與正常組和PBS對(duì)照組相比均延長(zhǎng)(P＜0.05)，以Aβ1-42寡聚體組變化更顯著。見(jiàn)表1。

表1 逃避潛伏期的變化(s，n=15，±s)

表1 逃避潛伏期的變化(s，n=15，±s)

與正常組比較:*P＜0.05;與Aβ1-42寡聚體組比較:#P＜0.05;與造模前比較:ΔP＜0.05

?

2.2 皮質(zhì) Bcl-2 mRNA、Caspase-3 mRNA 表達(dá)水平 與正常組相比，Aβ1-42纖維組、Aβ1-42寡聚體組的Bcl-2 mRNA表達(dá)降低(P＜0.05)，而Caspase-3 mRNA的表達(dá)增高(P＜0.05);與Aβ1-42纖維組比較，Aβ1-42寡聚體組變化更明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)Bcl-2 mRNA、Caspase-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(n=5，xˉ±s)

圖2 各組大鼠皮質(zhì)Bcl-2、Caspase-3蛋白的表達(dá)水平(n=5，±s)

2.3 皮質(zhì)Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)水平 Aβ1-42纖維組和Aβ1-42寡聚體組大鼠皮質(zhì)Bcl-2蛋白表達(dá)比正常組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而有活性的Caspase-3在Aβ1-42纖維組和Aβ1-42寡聚體組表達(dá)增高(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

3 討論

3.1 Aβ1-42寡聚體神經(jīng)毒性對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響 AD患者腦內(nèi)老年斑的Aβ主要是以纖維體的形式存在，Aβ寡聚體是纖維體的一種過(guò)渡形式，是目前認(rèn)為具有較大神經(jīng)毒性的Aβ存在形式。Aβ對(duì)神經(jīng)元有毒性作用，在體內(nèi)外均可引起神經(jīng)元凋亡，其異常代謝將會(huì)導(dǎo)致各種病理改變，在AD發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用［5］。

利用Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化。大腦額葉皮質(zhì)和海馬在學(xué)習(xí)記憶中起著重要作用。當(dāng)大腦皮質(zhì)和海馬病變時(shí)，其學(xué)習(xí)記憶能力會(huì)受到影響，而具有神經(jīng)毒性的Aβ寡聚體主要沉積在皮質(zhì)和海馬中，從而影響學(xué)習(xí)記憶能力。本研究在造模前進(jìn)行的水迷宮試驗(yàn)主要是觀察大鼠的學(xué)習(xí)能力，而給藥后再次使用水迷宮試驗(yàn)是對(duì)記憶的提取和再鞏固，根據(jù)造模前后兩次逃避潛伏期長(zhǎng)短的變化來(lái)判斷Aβ寡聚體對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，造模前各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力無(wú)明顯差異，造模4周后，Aβ1-42纖維組、Aβ1-42寡聚體組逃避潛伏期較造模前均延長(zhǎng)，但以Aβ1-42寡聚體組變化更顯著，正常組和PBS對(duì)照組無(wú)明顯變化，由此可知Aβ1-42寡聚體比Aβ1-42纖維毒性更大，更易損害AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。當(dāng)寡聚體Aβ轉(zhuǎn)化成纖維化Aβ，其神經(jīng)毒性會(huì)降低。成年動(dòng)物大腦皮質(zhì)神經(jīng)元在正常情況下不具有分裂增殖能力，但在一定誘導(dǎo)條件下可分裂再生。Varvel et al［6］發(fā)現(xiàn)在體外制備的Aβ寡聚體，在皮質(zhì)神經(jīng)元分裂的過(guò)程中可誘導(dǎo)DNA的合成，但這一過(guò)程可被特定的Aβ寡聚體抗體阻止，低分子量的Aβ寡聚體可誘導(dǎo)AD模型小鼠的神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞分裂周期。

3.2 Caspase-3與 Aβ1-42寡聚體的細(xì)胞毒性Caspase-3在細(xì)胞凋亡中扮演重要角色。有研究［7］表明Caspase-3首先定位于AD患者突觸后密集區(qū)，并在這一區(qū)域表達(dá)升高，其在突觸變性疾病進(jìn)展過(guò)程中起重要作用。本研究檢測(cè)各組AD大鼠皮質(zhì)的Caspase-3 mRNA的表達(dá)及Caspase-3活性，與正常組及PBS對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)，Aβ1-42纖維組和Aβ1-42寡聚體組皮質(zhì) Caspase-3 mRNA表達(dá)上調(diào)，Caspase-3活性增高，其在Aβ1-42寡聚體組中變化更顯著，故可知 Aβ1-42寡聚體能誘導(dǎo) Caspase-3 mRNA表達(dá)，激活Caspase-3，更容易誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有活性的Caspase-3會(huì)引發(fā)廣泛的神經(jīng)元破壞和退化，但不引起神經(jīng)元細(xì)胞急性死亡［8］。

3.3 Bcl-2與Caspase-3的關(guān)系 Bcl-2是一個(gè)抑制凋亡基因，作為Caspase上游調(diào)控機(jī)制，其過(guò)度表達(dá)能抑制各種因素誘發(fā)的Caspase激活和凋亡，可能通過(guò)抑制細(xì)胞色素C等從線粒體的釋放調(diào)控著線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)啟，從而抑制Caspase-3活化。另外，Bcl-2還可阻止線粒體釋放Caspase-3，并抑制其合成［9］。Bcl-2又是Caspase-3的直接底物，Bcl-2蛋白的環(huán)區(qū)可被 Caspase-3在 Asp34處剪切［10］。如果Bcl-2表達(dá)水平改變的同時(shí)伴隨著天門冬氨酸受體的改變，可導(dǎo)致鈣離子失衡，從而激活Caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［4］。

本研究顯示，與正常組和 PBS對(duì)照組相比，Aβ1-42纖維組及 Aβ1-42寡聚體組皮質(zhì)中 Bcl-2 mRNA及Bcl-2蛋白表達(dá)均降低，其中Aβ1-42寡聚體組的Bcl-2變化更明顯。由此可知當(dāng)Aβ1-42激活Caspase酶原后，Bcl-2表達(dá)減少，細(xì)胞抑制凋亡的能力減弱，促凋亡的作用增強(qiáng)。

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