倪文凱，于東風，劉 弋

凋亡是正常機體細胞保持穩(wěn)定的重要措施之一，是調(diào)節(jié)機體組織平衡的重要機制，是一個受到嚴密監(jiān)控的過程?；虻漠惓８淖儠е录毎蛲鍪艿揭种疲罱K導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［1］。凋亡抑制蛋白Livin是凋亡抑制蛋白家族(IAPs)中的新成員，特異的高表達于某些實體腫瘤組織和腫瘤細胞系中［2］。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)是一種促凋亡因子，是半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶族中的一員，是執(zhí)行細胞凋亡的主要酶類之一［3］。為了研究兩者對十二指腸腺癌發(fā)生發(fā)展的影響，該研究通過免疫組化法檢測十二指腸腺癌中兩者的表達情況，旨在探討二者在十二指腸腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的相互作用，從而為十二指腸腺癌的診斷與臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集我院2006年1月～2012年12月經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)病理驗證的有完整臨床資料的十二指腸腺癌患者的存檔組織蠟塊60例作為實驗組，其中男32例，女28例，年齡36～84歲，平均45.4歲。所有患者術(shù)前均未接受化療及放療。同時選取同組病例癌旁正常組織標本30例作為對照組。

1.2 主要試劑 兔抗人Livin多克隆抗體及兔抗人Caspase-9多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;通用型二步法檢測試劑盒(PV-6000)、PBS緩沖液、枸櫞酸緩沖液、DAB顯色液等均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法 采用免疫組化PV-6000兩步法。每次染色均設(shè)立陽性及陰性對照組，(以PBS液代替一抗作為陰性對照)。結(jié)果判斷:Livin以細胞質(zhì)和(或)細胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性。Caspase-9以細胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性。選擇合適部位選取5個高倍視野，每個高倍鏡視野計數(shù)100個細胞，高倍鏡下計數(shù)陽性細胞比例，以＞20%為陽性表達。

1.4 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，各組之間比較相關(guān)性檢驗和χ2檢驗，并計算Pearson列聯(lián)系數(shù)r。

2 結(jié)果

2.1 Livin及Caspase-9在十二指腸腺癌及癌旁組織中的表達情況 Livin及Caspase-9在十二指腸腺癌及癌旁組織均有陽性表達，其中Livin在實驗組中的陽性率明顯高于對照組(P＜0.01)，Caspase-9在實驗組中的陽性率明顯低于對照組(P＜0.01)。見表1、圖1。

2.2 Livin、Caspase-9在十二指腸腺癌中的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Livin的表達與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤發(fā)生部位比較差異無統(tǒng)計學意義，與腫瘤浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，Caspase-9的表達與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤發(fā)生部位及浸潤深度比較差異無統(tǒng)計學意義，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤的分化程度比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

2.3 Livin與Caspase-9在十二指腸腺癌中表達相關(guān)性分析 43例Livin蛋白陽性表達的十二指腸腺癌組織中7例Caspase-9表達陽性，17例Livin蛋白陰性的十二指腸腺癌中有8例Caspase-9表達陽性。Livin與Caspase-9的表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，r=－0.320)，見表3。兩者的表達呈負相關(guān)性。

表1 Livin在十二指腸腺癌及癌旁組織中的表達情況［n(%)］

圖1 十二指腸腺癌及癌旁正常組織中Livin及Caspase-9的表達 SP×400

表2 Livin、Caspase-9的表達與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系［n(%)］

表3 十二指腸腺癌中Livin與Caspase-9表達之間的關(guān)系［n(%)］

3 討論

細胞凋亡是機體重要的生理過程，對維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有著關(guān)鍵的作用。細胞凋亡功能的異常最終導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Livin基因位于人染色體20q13.3，全長4 600 bp，包含6個內(nèi)含子和7個外顯子。其編碼的Livin蛋白含有IAP家族成員中特有的BIR結(jié)構(gòu)和RING指結(jié)構(gòu)。其中RING結(jié)構(gòu)調(diào)控著Livin蛋白在細胞內(nèi)的合理分布，BIR結(jié)構(gòu)是Livin蛋白發(fā)揮抗凋亡作用的重要結(jié)合部位，通過與Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 以及凋亡前體蛋白SMAC等酶的結(jié)合，達到阻斷凋亡受體以及以線粒體為基礎(chǔ)的凋亡途徑而起到抑制細胞凋亡的作用［4］。Yagihashi et al［5］通過酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測癌癥患者血清中抗Livin抗體，發(fā)現(xiàn)肺癌、乳腺癌、腎癌、食管癌、胃癌、膽管癌和結(jié)直腸癌患者血清中抗Livin抗體高表達 。Xi et al［6］用免疫組化法發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌患者中Livin呈高表達，其表達水平與患者總體生存率呈負相關(guān)。本實驗結(jié)果表明Livin在對照組中低表達，實驗組中高表達，并與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與腫瘤的分化程度呈負相關(guān)，提示Livin表達的升高可能與十二指腸腺癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)系，同時Livin的表達可能影響十二指腸癌的生物學行為，使其發(fā)生轉(zhuǎn)移等惡性轉(zhuǎn)化行為，有可能成為癌癥預(yù)后及治療情況的判斷指標之一。

Caspase-9是內(nèi)源性凋亡途徑中的關(guān)鍵蛋白酶，當細胞接收到凋亡信號后，線粒體釋放Cyt C及凋亡活化因子(Apaf-1)。兩者結(jié)合以后形成凋亡小體，共同激活Caspase-9，活化后的Caspase-9進一步激活下游的效應(yīng)Caspase，從而參與調(diào)節(jié)過程［7］。本研究顯示Caspase-9在實驗組的陽性表達明顯低于對照組，并且與腫瘤有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)，與腫瘤的分化程度呈正相關(guān)。提示Caspase-9的異常表達參與了十二指腸腺癌的發(fā)生和發(fā)展。

Kasof et al［8］通過實驗證明:Livin 能夠直接抑制 Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 的水解作用，Livin蛋白的BIR結(jié)構(gòu)能夠與Caspase結(jié)合從而抑制其功能。同時Livin還能直接在凋亡的起始點干擾Procaspase-9或者直接干擾Caspase-9的活性［9］。本研究表明Livin與Caspase-9的表達呈負相關(guān)性。Livin蛋白和Caspase-9的具體作用機制以及兩者之間的關(guān)系還有待進一步的研究證實。二者的聯(lián)合檢測可視為判斷患者預(yù)后以及治療效果的重要標志和預(yù)測因子。

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