李漫麗 戚卉 吳雅臻

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose-regulated protein，GRP)78屬于熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)70家族，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上最多的分子伴侶蛋白，被認(rèn)為是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志性分子，并具有保護(hù)細(xì)胞、抵抗細(xì)胞凋亡的作用。GRP78涉及到多種細(xì)胞的增殖、存活、轉(zhuǎn)移等演化過程，目前被廣泛研究[1]。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞能夠分泌一系列細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)局部免疫反應(yīng)，對維持穩(wěn)定的視網(wǎng)膜免疫環(huán)境起重要作用，RPE的異常病理變化在多種視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。本研究通過體外培養(yǎng)人RPE細(xì)胞，以氯化鈷(cobalt chloride，CoCl2)誘發(fā)缺氧模型[2]、過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)誘發(fā)氧化應(yīng)激模型[3-4]，分別觀察缺氧、氧化應(yīng)激對RPE細(xì)胞增殖活力的影響及GRP78表達(dá)的變化，為研究RPE細(xì)胞對不同應(yīng)激的反應(yīng)機(jī)制提供依據(jù)，也為GRP78的功能研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要材料人RPE細(xì)胞株(D407)購自中山眼科中心，GRP78多克隆抗體購自Invotrigen公司，免疫組織化學(xué)試劑Biotin SP-HRP Kit、DMEM培養(yǎng)基、小牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司，MTT、二甲基亞砜購自美國Sigma公司，細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國Costar公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人RPE細(xì)胞株(D407)在含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中，用含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，用2.5 g·L-1胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化，用含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞制成100×103mL-1的細(xì)胞懸液，分別接種于96孔、6孔培養(yǎng)板內(nèi)。96孔培養(yǎng)板以每孔20×103個(gè)細(xì)胞接種，用于四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測定細(xì)胞存活率；6孔培養(yǎng)板中預(yù)先放入高壓滅菌過的玻璃蓋玻片，接種細(xì)胞密度為2.5×106個(gè)·mL-1，每孔2.5 mL細(xì)胞懸液，用于細(xì)胞爬片行免疫細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為量-效關(guān)系組和時(shí)-效關(guān)系組，量-效關(guān)系組觀察不同濃度的CoCl2、H2O2對RPE細(xì)胞增殖的影響，分組方法：(1)空白對照組：常規(guī)培養(yǎng)RPE細(xì)胞；(2)化學(xué)缺氧組：設(shè)Co1組、Co2組、Co3組、Co4組，即培養(yǎng)基中CoCl2終濃度分別為100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、400 μmol·L-1、800 μmol·L-1；(3)氧化應(yīng)激組：設(shè)H1組、H2組、H3組、H4組，即培養(yǎng)基中H2O2終濃度分別為100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、400 μmol·L-1、800 μmol·L-1。其中化學(xué)缺氧組和氧化應(yīng)激組細(xì)胞分別經(jīng)不同濃度的CoCl2、H2O2作用12 h后，更換培養(yǎng)液，使用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。根據(jù)量-效關(guān)系組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在CoCl2終濃度為200 μmol·L-1、H2O2終濃度為400 μmol·L-1的基礎(chǔ)上，設(shè)立時(shí)-效關(guān)系分組，觀察CoCl2、H2O2作用不同時(shí)間對RPE細(xì)胞GRP78表達(dá)的影響，分組方法：(1)空白對照組：常規(guī)培養(yǎng)RPE細(xì)胞；(2)化學(xué)缺氧組：加入CoCl2，使其終濃度為200 μmol·L-1，設(shè)Co8 h組、Co12 h組、Co16 h組，即CoCl2作用時(shí)間分別為8 h、12 h、16 h；(3)氧化應(yīng)激組：加入H2O2，使其終濃度為400 μmol·L-1，設(shè)H8 h組、H12 h組、H16 h組，即H2O2作用時(shí)間分別為8 h、12 h、16 h。

1.4MTT法檢測細(xì)胞活力收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，接種于96孔板，每孔200 μL，置37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁；小心吸去上清，加入20 μL MTT溶液(以PBS配制成5 g·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸掉上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；在BIO-RAD550型酶聯(lián)免疫檢測儀(美國)490 nm處測量各孔的吸光值(OD值)。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以細(xì)胞存活率計(jì)算：細(xì)胞存活率=處理組的OD值/對照組的OD值×100%，各實(shí)驗(yàn)組每組設(shè)12孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測GRP78蛋白表達(dá)情況取出細(xì)胞爬片，40 g·L-1多聚甲醛固定，正常山羊血清封閉液室溫孵育20 min，滴加GRP78多克隆抗體(1500稀釋)，4 ℃孵育過夜；滴加過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，DAB顯色5 min，蒸餾水洗滌以終止反應(yīng)；充分水洗后，蘇木素輕度復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照采用PBS代替一抗。顯微鏡下觀察RPE細(xì)胞中GRP78的表達(dá)情況，染色陽性反應(yīng)物質(zhì)表現(xiàn)為棕黃色顆粒。每組標(biāo)本3張爬片，每張爬片隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)棕黃色陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞率，即陽性細(xì)胞率=陽性細(xì)胞數(shù)/總體細(xì)胞數(shù)×100%，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1不同濃度CoCl2、H2O2對RPE細(xì)胞存活率的影響在光鏡下觀察，正常體外培養(yǎng)的RPE細(xì)胞生長旺盛，呈多角形，細(xì)胞緊密排列成簇生長，細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)，排列緊密，長滿后表現(xiàn)為接觸性抑制；化學(xué)缺氧組、氧化應(yīng)激組細(xì)胞體積明顯變小，貼壁能力減弱，可見漂浮的死亡細(xì)胞。MTT測定結(jié)果顯示，化學(xué)缺氧各濃度組與空白對照組相比細(xì)胞活性均下降，而且細(xì)胞的凋亡率與CoCl2誘導(dǎo)濃度呈正相關(guān)。對不同濃度CoCl2、H2O2干預(yù)組細(xì)胞存活率分別行單因素方差分析，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P=0.000)；用SNKq檢驗(yàn)分別分析不同藥物濃度干預(yù)組與空白對照組間的差異情況，結(jié)果顯示，除100 μmol·L-1和200 μmol·L-1H2O2組與空白對照組間細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)外，其余各實(shí)驗(yàn)組與空白對照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。不同濃度CoCl2、H2O2對RPE細(xì)胞存活率的影響見圖1。

2.2GRP78在RPE細(xì)胞中表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)分析正常培養(yǎng)的RPE細(xì)胞中即有GRP78表達(dá)。GRP78表達(dá)的典型免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果見圖2。各組RPE細(xì)胞中GRP78陽性細(xì)胞率統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：空白對照組為(5.4±3.0)%；Co8 h、Co12 h、Co16 h組分別為(34.2±7.1)%、(54.4±9.1)%、(34.7±6.8)%；H8 h、H12 h、H16 h組分別為：(37.8±7.1)%、(57.4±5.1)%、(42.5±3.9)%。對各組GRP78陽性細(xì)胞率進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示，化學(xué)缺氧組、氧化應(yīng)激組與空白對照組各組間總體差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)；化學(xué)缺氧組間經(jīng)SNKq檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除Co8 h組與Co16 h組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，其余各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)；氧化應(yīng)激組間經(jīng)SNKq檢驗(yàn)，除H8 h組與H16 h組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，其余各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。可見，在200 μmol·L-1CoCl2、400 μmol·L-1H2O2作用下，GRP78的表達(dá)均呈先升高后下降的趨勢，即CoCl2、H2O2作用12 h組GRP78的表達(dá)量最高，當(dāng)藥物作用時(shí)間延長到16 h時(shí)，GRP78的表達(dá)又出現(xiàn)下降，但仍強(qiáng)于空白對照組(P<0.01)。

Figure 1 Effects of different concentration of CoCl2,H2O2 on survival rate of RPE cells 不同濃度CoCl2、H2O2對RPE細(xì)胞存活率的影響

Figure 2 Expression of GRP78 in RPE cells by immunocytochemistry staining(SP，×400).A:Control group,the positive GRP78 cells were seldom observed;B:200 μmol·L-1 CoCl2 group,there were many positive GRP78 cells;C:400 μmol·L-1 H2O2 group,there were many positive GRP78 cells RPE細(xì)胞中GRP78表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色(SP，×400)。A：空白對照組，GRP78少量表達(dá)；B：200 μmol·L-1 CoCl2組，GRP78大量表達(dá)；C：400 μmol·L-1 H2O2組，GRP78大量表達(dá)

3 討論

深入探討視網(wǎng)膜損傷的分子生物學(xué)機(jī)制，選擇和評價(jià)早期、特異、敏感的生化標(biāo)志物，對于多種視網(wǎng)膜疾病的診斷、治療和早期預(yù)警都有重要意義。GRP78屬于HSP70家族，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上最多的分子伴侶蛋白，生理情況下GRP78在基礎(chǔ)水平表達(dá)，主要作用是作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)的折疊和亞基的組裝、運(yùn)輸以及降解等過程，以滿足內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)新合成多肽鏈向成熟型蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的需要，調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的活性和功能，當(dāng)細(xì)胞在缺血、缺氧、低糖、氧化應(yīng)激、鈣離子失衡等環(huán)境下時(shí)，許多細(xì)胞內(nèi)蛋白發(fā)生變性，導(dǎo)致大量多肽鏈和錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積聚，此時(shí)GRP78的表達(dá)量顯著增高，所以GRP78被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志性分子，GRP78的表達(dá)多少對決定應(yīng)激細(xì)胞的結(jié)局，如抵抗、適應(yīng)、損傷或凋亡等有重要作用，對這方面的研究無論在科學(xué)理論還是在應(yīng)用前景上都具有重大意義[5-7]。根據(jù)目前的研究，GRP78在多種疾病的發(fā)生中起重要作用，例如缺血性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病、腫瘤、糖尿病和肝炎、胃炎、病毒感染等。近年對GRP78的功能和調(diào)節(jié)機(jī)制有了更深入的了解，證實(shí)了檢測GRP78的表達(dá)情況可敏感反映細(xì)胞的受損情況。目前GRP78已被眾多學(xué)者作為一項(xiàng)重要指標(biāo)廣泛應(yīng)用于重要組織器官損傷的基礎(chǔ)研究中。視網(wǎng)膜代謝旺盛，對缺血、缺氧等刺激很敏感，HSP家族在視網(wǎng)膜細(xì)胞中的作用已被廣泛研究[8]。Barber等[9]發(fā)現(xiàn)，熱誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞高表達(dá)HSP70能抵抗強(qiáng)光導(dǎo)致的視網(wǎng)膜損傷；Bailey等[10]的研究也證明，高表達(dá)HSPs的RPE細(xì)胞對高濃度H2O2損傷具有抵抗性；Surgucheva等[11]介紹了HSP70在視網(wǎng)膜退行性病變?nèi)缋夏晷渣S斑病變和視網(wǎng)膜葡萄膜炎中的作用。而作為HSP家族中重要的成員，GRP78在視網(wǎng)膜病變發(fā)病中的作用目前少有報(bào)道。為深入探討視網(wǎng)膜缺氧、氧化應(yīng)激與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間的關(guān)系，闡明GRP78在視網(wǎng)膜損傷發(fā)生發(fā)展中的變化規(guī)律，及為尋找視網(wǎng)膜損傷敏感特異的生物標(biāo)志物奠定基礎(chǔ)，我們開展了本實(shí)驗(yàn)，分析缺氧、氧化應(yīng)激對RPE細(xì)胞GRP78表達(dá)的影響。

RPE細(xì)胞是視網(wǎng)膜屏障的一部分，參與了脈絡(luò)膜毛細(xì)血管與視網(wǎng)膜感光細(xì)胞之間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，具有重要的生物學(xué)及解剖學(xué)功能。RPE細(xì)胞的異常病理變化在多種視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生發(fā)展過程中占重要地位，所以探討RPE細(xì)胞在缺氧、氧化應(yīng)激等病理情況下的異常生物學(xué)行為可能會(huì)為多種疾病的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防和治療奠定理論基礎(chǔ)[11-12]。本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)了人RPE細(xì)胞株D407，分別觀察缺氧、氧化應(yīng)激對RPE細(xì)胞增殖活力的影響，并研究應(yīng)激狀況下RPE細(xì)胞GRP78表達(dá)的變化。我們采用化學(xué)缺氧方法，以CoCl2成功模擬細(xì)胞缺氧環(huán)境，同時(shí)以H2O2誘導(dǎo)建立體外RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，方法簡便，條件易控制。同時(shí)采用了近年來應(yīng)用較為廣泛的MTT比色法檢測細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著細(xì)胞培養(yǎng)液中CoCl2和H2O2濃度的增加，體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞在酶標(biāo)儀490 nm所測定的吸光度值逐漸降低，提示一定程度的缺氧、氧化應(yīng)激可抑制RPE細(xì)胞生長，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致[13]。我們又通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察RPE細(xì)胞中GRP78的表達(dá)情況。根據(jù)He等[14]的研究，胎兒視網(wǎng)膜組織中無GRP78表達(dá)，而成人視網(wǎng)膜組織中GRP78中等量表達(dá)；我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞中GRP78少量表達(dá)。He等[14]的實(shí)驗(yàn)通過叔丁基氫過氧化物(tBH)誘導(dǎo)人RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，證實(shí)了tBH 可誘導(dǎo)GRP的表達(dá)顯著增高；我們觀察固定濃度的CoCl2和H2O2作用于RPE細(xì)胞不同時(shí)間后，GRP78表達(dá)的改變，結(jié)果表明，GRP78的表達(dá)均呈先升高后下降的趨勢，證實(shí)了CoCl2、H2O2均可作為應(yīng)激原刺激RPE細(xì)胞中GRP78的高表達(dá)。分析其作用機(jī)制可能為 GRP78的表達(dá)量顯著增高，一方面能夠識別變性蛋白，協(xié)助它們進(jìn)行重新折疊、裝配和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)；另一方面將無法恢復(fù)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移給蛋白降解系統(tǒng)，從而避免細(xì)胞進(jìn)一步受到傷害，此機(jī)制提高了細(xì)胞在應(yīng)激情況下的生存能力和促進(jìn)應(yīng)激后細(xì)胞康復(fù)[15-16]。隨著應(yīng)激的加強(qiáng)，GRP78的表達(dá)又出現(xiàn)下降，原因可能是長期過強(qiáng)的應(yīng)激使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，GRP78合成受阻，細(xì)胞啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的凋亡程序，RPE細(xì)胞凋亡增加。我們的研究結(jié)果表明，短時(shí)應(yīng)激可通過促進(jìn)GRP78表達(dá)增加來保護(hù)細(xì)胞，但這種緩沖作用是有一定限度的，長期嚴(yán)重的損害使GRP78的合成減少，細(xì)胞將啟動(dòng)凋亡程序，使細(xì)胞死亡。

綜上，GRP78可以作為RPE細(xì)胞缺氧、氧化應(yīng)激的生化標(biāo)志物，GRP78的表達(dá)變化與細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)有一定依賴關(guān)系。對GRP78在視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷中作用的研究可為多種玻璃體視網(wǎng)膜疾病的發(fā)病機(jī)制和治療方法提供新的思路。

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