修立恒 劉洪濤 曾小平

角膜的透明性是細(xì)胞結(jié)構(gòu)和層次交錯(cuò)排列平衡的直接結(jié)果[1]，也是促進(jìn)和抑制新生血管形成因子之間調(diào)節(jié)平衡的間接作用結(jié)果。已有研究表明血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、一氧化氮(nitric oxide，NO)和缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)等均在新生血管形成過程中有著重要作用[2-3]。而病理情況下NO主要是由誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)催化合成，并且還發(fā)現(xiàn)氨基胍為一種相對(duì)選擇性iNOS抑制劑，能夠特異性抑制iNOS的表達(dá)[4]。本實(shí)驗(yàn)通過兔眼堿燒傷建立角膜新生血管模型，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)iNOS、VEGF在兔角膜堿燒傷后不同時(shí)間段的表達(dá)，以探討iNOS對(duì)角膜堿燒傷后新生血管形成的影響。

1 材料與方法

1.1材料健康新西蘭大白兔30只，雌雄兼?zhèn)?，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由重慶市騰鑫比爾動(dòng)物有限公司提供，裂隙燈下檢查無眼表疾病。氨基胍(美國(guó)Sigma公司)，復(fù)方托吡卡胺眼液(參天制藥株式會(huì)社)，妥布霉素眼液(美國(guó)Alcon公司)，小鼠抗兔VEGF單克隆抗體、免疫組織化學(xué)兔鼠通用型二抗試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，小鼠抗兔iNOS單克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1角膜堿燒傷新生血管模型的制備30只大白兔均選取右眼為實(shí)驗(yàn)眼，用30 g·L-1的戊巴比妥鈉按1 mL·kg-1的劑量從兔耳緣靜脈緩慢注射，待全身麻醉成功后，再用丙美卡因眼液滴右眼局部麻醉，開瞼器開瞼，棉簽吸干眼表多余的液體后，將直徑為8 mm的浸有1 mol·L-1NaOH的無菌圓形濾紙，放于角膜中央1 min，快速用生理鹽水充分沖洗結(jié)膜囊及眼表2 min，建立角膜堿燒傷模型。建模后局部予以氧氟沙星眼膏和復(fù)方托吡卡胺滴眼預(yù)防瞼球、虹膜感染及粘連。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：角膜水腫，明顯混濁，基質(zhì)層受損，虹膜仍隱約可見。術(shù)后角膜感染、穿孔的均不納入實(shí)驗(yàn)觀察范圍。建模成功后隨機(jī)均分為兩組，每組各15只。術(shù)后第1天開始每天實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組分別予以5 g·L-1氨基胍液(0.25 g氨基胍溶于50 mL磷酸鈉緩沖液)和磷酸鈉緩沖液滴右眼，每天4次；此外，兩組均用妥布霉素眼液滴右眼，每天4次；復(fù)方托吡卡胺眼液滴右眼，每天2次。

1.2.2角膜新生血管的觀察與測(cè)量方法建模后每天觀察角膜新生血管生長(zhǎng)情況，分別在堿燒傷后第4天、第7天、第14天時(shí)隨機(jī)選取5只兔右眼拍照，測(cè)量并記錄角膜新生血管長(zhǎng)度(以連續(xù)彎曲度小且朝向角膜中心生長(zhǎng)的最長(zhǎng)血管的垂直長(zhǎng)度為準(zhǔn))，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組角膜新生血管面積均按Robert電腦教學(xué)模型公式：S=C/12×3.14×[r2-(r-l)2][5]，其中r為角膜半徑，C為新生血管累及角膜的圓周鐘點(diǎn)數(shù)，l為角膜新生血管的長(zhǎng)度。

1.2.3HE染色及免疫組織化學(xué)檢測(cè)iNOS、VEGF的表達(dá)分別于燒傷后第4天、第7天、第14天隨機(jī)選取5只兔子用空氣栓塞的方法處死，無菌條件下剪下帶1 mm寬鞏膜的角膜組織(含角膜緣)，將標(biāo)本固定于40 g·L-1多聚甲醛溶液中12 h后，常規(guī)石蠟包埋，將包埋好的組織塊平行于角膜表面連續(xù)厚4 μm切片。常規(guī)HE染色。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)iNOS、VEGF蛋白的表達(dá)：常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水Ⅰ、Ⅱ涮洗各5 min，放入檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(pH 6.0)中，微波中火修復(fù)10 min，PBS沖洗5 min×3次；滴加血清封閉20 min，分別滴加25 μL小鼠抗兔VEGF單克隆抗體稀釋液(1350)和小鼠抗兔iNOS單克隆抗體稀釋液(1200)覆蓋組織，4 ℃過夜?jié)窈蟹跤?8 h。次日，室溫下PBS沖洗5 min×3次；滴加25 μL兔鼠通用型二抗室溫濕盒孵育15 min，PBS沖洗5 min×3次。DAB顯色30 s自來水終止，蘇木素復(fù)染5 min，脫水透明烘干后中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察各組角膜組織中iNOS、VEGF表達(dá)的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定：細(xì)胞漿或細(xì)胞膜出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。用IPWIN60軟件的免疫組織化學(xué)圖像自動(dòng)分析模塊的Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對(duì)每組拍到的圖像中陽(yáng)性反應(yīng)部位(胞漿或胞膜)進(jìn)行分析，測(cè)得IOD(sum)值，IOD值越大，表示陽(yáng)性表達(dá)越多。

2 結(jié)果

2.1堿燒傷后裂隙燈下觀察結(jié)果堿燒傷后兔眼分泌物多且角膜炎癥反應(yīng)嚴(yán)重，堿燒傷后第1天僅可見角膜緣血管網(wǎng)充盈，無新生血管長(zhǎng)入角膜上；傷后第2天角膜緣開始出現(xiàn)新生血管；傷后第4天角膜新生血管粗大且密集，呈毛刷狀；傷后第7天角膜緣發(fā)現(xiàn)新生血管較第4天時(shí)稀疏但長(zhǎng)度增加；傷后第14天角膜新生血管更稀疏且向角膜上延伸更長(zhǎng)。

2.2角膜新生血管面積傷后第4天、第7天、第14天實(shí)驗(yàn)組角膜新生血管面積分別為：(50.18±1.60)mm2、(86.53±2.27)mm2、(108.31±2.01)mm2；對(duì)照組角膜新生血管面積為(70.04±2.85)mm2、(116.34±2.02)mm2、(151.40±0.58)mm2；在堿燒傷后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組新生血管面積均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。

2.3HE染色通過HE染色觀察兔眼堿燒傷后各時(shí)間點(diǎn)角膜組織的形態(tài)發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組較實(shí)驗(yàn)組角膜組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)更嚴(yán)重，新生血管更密集，新生血管管腔更粗大，基質(zhì)層膠原纖維斷裂溶解更多。

2.4角膜組織iNOS、VEGF的免疫組織化學(xué)結(jié)果分析iNOS、VEGF主要在新生血管內(nèi)皮細(xì)胞及炎癥細(xì)胞胞漿、胞膜表達(dá)。堿燒傷后第4天，iNOS、VEGF表達(dá)量達(dá)到峰值，隨時(shí)間點(diǎn)推移呈逐漸下降趨勢(shì)。傷后第4天、第7天、第14天實(shí)驗(yàn)組角膜組織iNOS、VEGF的IOD值均較對(duì)照組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05，見表1-表2，圖1-圖2)，且iNOS與VEGF表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.998，P<0.05)。

Figure 1 Corneal iNOS immunohistochemical expression at different time in two groups (×400).A:The 4th day after alkali burn in experimental group;B:The 7th day after alkali burn in experimental group;C:The 14th day after alkali burn in experimental group;D:The 4th day after alkali burn in control group;E:The 7th day after alkali burn in control group;F:The 14th day after alkali burn in control group 兩組堿燒傷后不同時(shí)期角膜iNOS免疫組織化學(xué)表達(dá)的情況(×400)。A：實(shí)驗(yàn)組堿燒傷后第4天；B：實(shí)驗(yàn)組堿燒傷后第7天；C：實(shí)驗(yàn)組堿燒傷后第14天；D：對(duì)照組堿燒傷后第4天；E：對(duì)照組堿燒傷后第7天；F：對(duì)照組堿燒傷后第14天

Figure 2 Corneal VEGF immunohistochemical expression at different time in two groups (×400).A:The 4th day after alkali burn in experimental group;B:The 7th day after alkali burn in experimental group;C:The 14th day after alkali burn in experimental group;D:The 4th day after alkali burn in control group;E:The 7th day after alkali burn in control group;F:The 14th day after alkali burn in control group 兩組堿燒傷后不同時(shí)期角膜VEGF免疫組織化學(xué)表達(dá)的情況(×400)。A：實(shí)驗(yàn)組堿燒傷后第4天；B：實(shí)驗(yàn)組堿燒傷后第7天；C：實(shí)驗(yàn)組堿燒傷后第14天；D：對(duì)照組堿燒傷后第4天；E：對(duì)照組堿燒傷后第7天；F：對(duì)照組堿燒傷后第14天

表1 角膜堿燒傷后不同時(shí)期VEGF的IOD值比較

表2 角膜堿燒傷后不同時(shí)期iNOS的IOD值比較

3 討論

新生血管在角膜上存在的方式有3種：后彈力層新生血管、基質(zhì)層新生血管和角膜血管翳[6]。從形態(tài)學(xué)上將傷后角膜新生血管的生成分為3個(gè)時(shí)期：非增殖期，僅角膜緣血管網(wǎng)擴(kuò)張，角膜上無新生血管；血管增殖期，新生血管生長(zhǎng)最快，角膜上新生血管粗密呈毛刷狀；血管退行期，新生血管生長(zhǎng)停滯，血管變得稀疏[7]。目前對(duì)于角膜新生血管的治療方法主要有：類固醇激素、非甾體類抗炎藥、VEGF拮抗劑、環(huán)孢素、實(shí)驗(yàn)性基因、激光和外科手術(shù)治療等[8]。

對(duì)于角膜新生血管的形成有如下學(xué)說：缺氧學(xué)說、細(xì)胞因子平衡學(xué)說、白細(xì)胞介導(dǎo)學(xué)說和炎癥學(xué)說等[9]。角膜新生血管化是多種因素共同作用的結(jié)果，主要是細(xì)胞因子失衡造成的。即角膜新生血管化是促進(jìn)和抑制新生血管形成因子之間調(diào)節(jié)失衡引起促進(jìn)新生血管形成因子過剩和抑制新生血管形成因子缺乏的結(jié)果[10]。VEGF在新生血管形成中起核心作用，NO、HIF等已經(jīng)被證實(shí)與新生血管形成相關(guān)[2-3]。雖然VEGF和NO等都在角膜新生血管生成過程中起到一定的作用，但是其參與這一過程的具體機(jī)理還不清楚[11]。常巖等[12]通過建立兔角膜堿燒傷模型用濃度為 5 g·L-1的Avastin眼液治療兔角膜堿燒傷，結(jié)果顯示抑制新生血管效果明顯，表明VEGF的表達(dá)水平與新生血管的形成密切相關(guān)。劉曉坤等[7]通過實(shí)驗(yàn)證明NO能促進(jìn)堿燒傷后角膜新生血管生長(zhǎng)，還發(fā)現(xiàn)VEGF與NO在促角膜新生血管形成方面具有協(xié)同作用。而NO是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化合成，目前發(fā)現(xiàn)至少存在3種NOS：內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)和iNOS，iNOS主要表達(dá)于炎癥激活的細(xì)胞因子及免疫細(xì)胞，其催化合成的NO是介導(dǎo)病理過程的重要調(diào)節(jié)因子。同時(shí)人們又發(fā)現(xiàn)氨基胍做為一種相對(duì)選擇性iNOS抑制劑，能夠特異性抑制iNOS，卻不會(huì)阻斷NOS催化合成NO來維持血管舒張狀態(tài)方面的功能[4]。

本實(shí)驗(yàn)通過裂隙燈顯微鏡、角膜組織HE染色和免疫組織化學(xué)方法來觀察兔眼角膜堿燒傷后角膜新生血管的變化并進(jìn)一步分析堿燒傷后角膜組織中VEGF、iNOS的表達(dá)與角膜新生血管生長(zhǎng)的關(guān)系，結(jié)果表明角膜新生血管形態(tài)變化和生長(zhǎng)速度與角膜組織VEGF、iNOS的表達(dá)變化相一致。同時(shí)發(fā)現(xiàn)堿燒傷后VEGF、iNOS的表達(dá)既從角鞏膜緣向角膜中央發(fā)展，也從角膜上皮層向角膜基質(zhì)層發(fā)展，這些都與裂隙燈下觀察兔眼堿燒傷后角膜新生血管的生長(zhǎng)情況相符合。在燒傷早期VEGF、iNOS大量表達(dá)，血管生長(zhǎng)速度很快，后期表達(dá)顯著降低，血管生長(zhǎng)速度也相應(yīng)減慢。由此可見VEGF、iNOS對(duì)新生血管生長(zhǎng)不僅在早期有誘導(dǎo)作用，還有后續(xù)促進(jìn)作用。所以VEGF、iNOS與角膜新生血管的形成及生長(zhǎng)關(guān)系密切。實(shí)驗(yàn)組使用5 g·L-1的氨基胍眼液治療后，新生血管面積較對(duì)照組顯著降低，VEGF、iNOS蛋白的IOD值也較對(duì)照組顯著降低，表明氨基胍作為一種選擇性iNOS抑制劑在抑制角膜新生血管生長(zhǎng)方面有顯著療效。由于iNOS通過合成NO來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，表明VEGF和NO參與新生血管形成的過程，可能對(duì)新生血管生長(zhǎng)起促進(jìn)作用，也進(jìn)一步說明VEGF和iNOS都可能參與角膜新生血管形成。

同時(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)兔眼堿燒傷后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)角膜組織中VEGF和iNOS蛋白表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，說明二者在促角膜新生血管形成過程中呈協(xié)同作用。而實(shí)驗(yàn)組在堿燒傷后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)角膜新生血管面積較對(duì)照組顯著降低，說明氨基胍可能通過抑制iNOS的表達(dá)來降低傷后角膜組織中NO的含量，進(jìn)而抑制角膜新生血管生長(zhǎng)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)說明VEGF和iNOS在促進(jìn)角膜新生血管形成方面呈協(xié)同作用，同時(shí)氨基胍對(duì)于防治角膜新生血管的生成和促進(jìn)受損角膜恢復(fù)透明有一定的作用，為角膜新生血管治療方面的研究提供了新的思路。但是氨基胍應(yīng)用的安全性尚需進(jìn)一步深入研究，以期為臨床病理狀態(tài)下角膜新生血管防治工作開辟更廣闊的前景。

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