石珂 趙璐 游志鵬 張倩 汪昌運

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是全球主要的不可逆致盲性眼病之一，據(jù)調(diào)查在美國有410萬成年人患有DR[1]。目前已公認(rèn)高血糖是DR重要的起始因素，體內(nèi)長期高血糖環(huán)境會損傷視網(wǎng)膜中視桿細(xì)胞等光感受器細(xì)胞。視桿細(xì)胞負(fù)責(zé)暗視覺，其損傷將嚴(yán)重影響患者的視功能[2]，如何抑制糖尿病患者視桿細(xì)胞等神經(jīng)細(xì)胞的損害已成為目前研究的熱點。根皮素是一種葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1(glucose transporter-1,GLUT1)抑制劑，早在1986年已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)根皮素可以抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運入肝[3]，目前已證實GLUT1是葡萄糖通過血-視網(wǎng)膜屏障的唯一載體[4]。我們設(shè)想利用根皮素限制GLUT1轉(zhuǎn)運葡萄糖進(jìn)入視網(wǎng)膜而降低視網(wǎng)膜組織含糖量，可能對視桿細(xì)胞等神經(jīng)元有一定的保護作用。本研究通過腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)建立糖尿病小鼠模型后予以根皮素，而后檢測并比較暗適應(yīng)視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram,ERG)振幅和視網(wǎng)膜外核層厚度，以判斷根皮素對糖尿病小鼠視網(wǎng)膜視桿細(xì)胞功能和形態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器復(fù)方托吡卡胺滴眼液(日本參天制藥株式會社)，重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子眼用凝膠(珠海億勝制藥公司)。STZ、根皮素和葡萄糖含量測定試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)，蛋白質(zhì)含量測定試劑盒(美國Bio-Rad公司)，檸檬酸緩沖液(北京天根生化科技有限公司)，電子分析天平(上海精科天平廠)，視網(wǎng)膜電圖儀(美國Diagnosys公司)，光譜分析儀(德國Spectro公司)，生物顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)。

1.2實驗動物與分組健康8周齡無眼疾近交系雄性C57BL/6小鼠18只，體質(zhì)量20～30 g，打上耳釘編號后根據(jù)隨機數(shù)字表隨機選取分為正常對照組、糖尿病對照組和根皮素治療組，每組6只。建立DM模型方法：小鼠禁食8 h后腹腔注射STZ連續(xù)5 d，注射前將STZ溶于pH 4.5的0.01 mol·L-1檸檬酸緩沖液里，而后糖尿病對照組和根皮素治療組予以50 mg·kg-1劑量注射，正常對照組予以等量檸檬酸鹽緩沖液腹腔注射。第7天采尾部靜脈血測量血糖，大于16.7 mmol·L-1即認(rèn)為建模成功。成模后根皮素治療組予以根皮素100 mg·kg-1灌胃，連續(xù)12周，隔日進(jìn)行1次灌胃；正常對照組和糖尿病對照組予以等量生理鹽水灌胃。18周后行暗適應(yīng)ERG檢查。

1.3暗適應(yīng)ERG檢查3組小鼠使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳后放于暗室過夜，第2天予以氯胺酮(10 mg·kg-1)和賽拉嗪(60 mg·kg-1)混合液麻醉。然后將小鼠置于加熱溫板上，參比電極和接地電極插入腭部和尾巴，鉑制角膜電極置于雙眼角膜上并予以重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子眼用凝膠潤滑，以上操作均在暗室弱紅光燈照明下完成。ERG儀設(shè)置光照強度0.0004 cd·s-1·m-2、 0.04 cd·s-1·m-2、 4 cd·s-1·m-2、 400 cd·s-1·m-2和 2000 cd·s-1·m-2分別記錄暗視ERG結(jié)果。

1.4視網(wǎng)膜組織含糖量檢測3組小鼠完成ERG檢查后頸椎脫臼法處死，摘除左眼球(右眼球另有他用)后取視網(wǎng)膜組織并加入50 μL去離子水，加熱至70～75 ℃共15 min，然后超聲裂解30 s，離心20 min后取上清液35 μL加入165 μL葡萄糖含量測定試劑里，并設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)曲線和空白對照，應(yīng)用光譜分析儀測定標(biāo)本的吸光度，然后應(yīng)用SPECTRO STAR NANO MARS軟件計算葡萄糖濃度。而后再取10 μL上清液加入190 μL蛋白質(zhì)含量測定試劑中，同樣設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)曲線和空白對照，應(yīng)用光譜分析儀測定標(biāo)本的吸光度，然后應(yīng)用SPECTRO STAR NANO MARS軟件計算蛋白質(zhì)濃度。視網(wǎng)膜葡萄糖含量以nmol glucose/mg protein表示，其計算公式為：視網(wǎng)膜組織含糖量=G·GV/(GMW·P·PV)，其中G:葡萄糖濃度(ng·mL-1)、GV：葡萄糖含量測定反應(yīng)液容積(mL)、P:蛋白質(zhì)濃度(mg·mL-1)、PV：蛋白質(zhì)含量測定反應(yīng)液容積(mL)、GMW：葡萄糖相對分子質(zhì)量(180.2)。

1.5視網(wǎng)膜外核層厚度測量在1.4步驟中摘除小鼠的右眼球后直接放入40 g·L-1多聚甲醛中固定1 h，而后剪除角膜和晶狀體后再次放入40 g·L-1多聚甲醛中固定15 min，PBS清洗后酒精梯度脫水，而后放入二甲苯Ⅰ及二甲苯Ⅱ中透明，浸蠟后包埋，切片(厚5 μm)后烤干。將制備完成的石蠟切片置入二甲苯Ⅰ及二甲苯Ⅱ中脫蠟，無水酒精漂洗，而后置入梯度酒精，放入蘇木精中染色10～30 min，水洗后放入體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸乙醇中褪色，再漂洗，放入梯度酒精脫水，再放入體積分?jǐn)?shù)0.5%伊紅乙醇液復(fù)染，再脫水，置入二甲苯Ⅰ及二甲苯Ⅱ中透明，封片。于顯微鏡下觀察切片并應(yīng)用ImagePro軟件分別測量距離視盤上下方0.48 mm、0.96 mm、1.44 mm、1.92 mm處的視網(wǎng)膜外核層厚度。

2 結(jié)果

2.13組小鼠視網(wǎng)膜組織的含糖量比較18周后正常對照組小鼠視網(wǎng)膜含糖量為(39.43±2.17)nmol glucose/mg protein，糖尿病對照組小鼠視網(wǎng)膜含糖量高達(dá)(142.25±6.92)nmol glucose/mg protein，根皮素治療組小鼠的視網(wǎng)膜含糖量為(97.82±4.12)nmol glucose/mg protein，兩組糖尿病模型小鼠的視網(wǎng)膜含糖量均高于正常對照組，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01)，但根皮素治療組小鼠視網(wǎng)膜含糖量低于糖尿病對照組，差異也有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.23組小鼠的暗適應(yīng)ERG比較糖尿病對照組和根皮素治療組的小鼠暗適應(yīng)ERG的a波及b波振幅均較正常對照組低，且差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01)，但根皮素治療組小鼠的暗適應(yīng)ERG a波及b波振幅較糖尿病對照組高，差異也均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01，見圖1、表1)。

Figure 1 Scotopic ERG of three groups.A:Normal control group;B:Diabetic control group;C:Phloretin treatment group 三組小鼠的暗適應(yīng)ERG表現(xiàn)。A：正常對照組；B：糖尿病對照組；C：根皮素治療組

表1 3組小鼠的暗適應(yīng)ERG振幅

2.33組小鼠視網(wǎng)膜外核層厚度比較成模18周后根皮素治療組和糖尿病對照組小鼠視網(wǎng)膜外核層厚度較正常對照組下降(6.28～16.05)%和(20.41～35.38)%，然而根皮素治療組的視網(wǎng)膜外核層厚度較糖尿病對照組小鼠厚(6.61～29.92)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。

Figure 2 Outer nuclear layer thickness of three groups(HE，×400).A:Normal control group;B:Diabetic control group;C:Phloretin treatment group 3組小鼠的視網(wǎng)膜外核層厚度(HE染色，×400)。A：正常對照組；B：糖尿病對照組；C：根皮素治療組

3 討論

DR是糖尿病最常見和嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,其發(fā)病機制目前尚不明確，但美國糖尿病多中心試驗研究DCCT揭示長時期高血糖是發(fā)生DR的決定性因素?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜高糖環(huán)境下產(chǎn)生的過量氧化應(yīng)激、蛋白激酶C的激活、糖基化終末產(chǎn)物的合成等啟動了視網(wǎng)膜組織細(xì)胞包括光感受器等神經(jīng)細(xì)胞的損傷[5-6]。視桿細(xì)胞是光感受器的重要組成部分，它對光的敏感度較高，負(fù)責(zé)人們在弱光下的視覺即暗視覺，視桿細(xì)胞損傷將導(dǎo)致夜盲癥等而直接影響患者生活質(zhì)量[7]，因此探索在糖尿病條件下對視桿細(xì)胞的保護以盡可能保全患者視功能意義重大。

既然糖尿病條件下視桿細(xì)胞所處的高糖微環(huán)境對其有損傷效應(yīng)，那么控制視網(wǎng)膜組織含糖量可能是解決此問題的一把鑰匙。視網(wǎng)膜中葡萄糖由血液轉(zhuǎn)運而來，但葡萄糖由于其水溶性而無法通過哺乳動物細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，視網(wǎng)膜組織細(xì)胞攝取葡萄糖需依靠一類轉(zhuǎn)運葡萄糖的載體蛋白即GLUT1[8]，在視網(wǎng)膜中GLUT-1除分布于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、光感受器細(xì)胞、Müller細(xì)胞、晶狀體細(xì)胞等外，大部分存在于血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的血管內(nèi)皮細(xì)胞和外屏障的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，GLUT1是葡萄糖通過血-視網(wǎng)膜屏障的唯一載體[9]。而根皮素可以競爭性抑制GLUT1對葡萄糖的運輸從而減少視網(wǎng)膜含糖量。本研究結(jié)果顯示：建立糖尿病模型后18周，根皮素治療組小鼠視網(wǎng)膜含糖量低于糖尿病對照組(P<0.01)，證明根皮素可以有效限制葡萄糖轉(zhuǎn)運進(jìn)入視網(wǎng)膜。

暗適應(yīng)ERG是閃光ERG檢測內(nèi)容的一部分，它是在暗適應(yīng)條件下給予弱光刺激時視桿細(xì)胞產(chǎn)生的電位，可在角膜表面無創(chuàng)記錄[10]。常用暗適應(yīng)ERG反映視桿細(xì)胞的功能狀態(tài)，研究已發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠在早期即出現(xiàn)暗適應(yīng)ERG異常[11]。同樣國內(nèi)也有報道應(yīng)用閃光ERG檢查發(fā)現(xiàn)非增殖期DR患者在未出現(xiàn)眼底新生血管等微血管病變時已出現(xiàn)視網(wǎng)膜光感受器功能障礙，其中視桿細(xì)胞功能尤為明顯[12]。本實驗發(fā)現(xiàn)糖尿病對照組和根皮素治療組小鼠暗適應(yīng)ERG的a波及b波波幅均比正常對照組小鼠低，與前述研究一致，但根皮素治療組比糖尿病對照組暗適應(yīng)ERG的a波及b波高。提示我們應(yīng)用根皮素后糖尿病小鼠視桿細(xì)胞的功能損害相對較輕，其原因可能是視網(wǎng)膜的相對低糖環(huán)境對視桿細(xì)胞產(chǎn)生了一定的保護作用。

視網(wǎng)膜外核層厚度主要反映視桿細(xì)胞的數(shù)量變化，動物實驗證實糖尿病大鼠建模后其外核層厚度隨著病程的延長而逐漸降低[13]，視桿細(xì)胞的退行性變及死亡是糖尿病患者在未出現(xiàn)DR之前視功能異常的主要原因，也是DR的重要病理改變[14]。本實驗同樣發(fā)現(xiàn)18周后兩組糖尿病模型小鼠的視網(wǎng)膜外核層厚度均小于正常對照組，提示我們本研究中糖尿病模型小鼠的視網(wǎng)膜視桿細(xì)胞在不斷死亡，但根皮素治療組各測量點的視網(wǎng)膜外核層厚度均較糖尿病對照組小鼠高，提示我們糖尿病小鼠在應(yīng)用根皮素后視桿細(xì)胞死亡數(shù)量相對較少，其原因同樣是低糖環(huán)境對視桿細(xì)胞的保護作用。

綜上所述，應(yīng)用GLUT1抑制劑根皮素后，糖尿病小鼠的視網(wǎng)膜含糖量下降，從而形成了一個視網(wǎng)膜相對低糖環(huán)境。在此環(huán)境下，視桿細(xì)胞的功能和形態(tài)學(xué)病變均較普通糖尿病小鼠有所緩解。這提示我們通過競爭性抑制GLUT1從而限制視網(wǎng)膜局部含糖量有可能成為未來防治DR的一個新方向。

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