孫 雯,潘秀珍

(1.揚州市職業(yè)大學醫(yī)學院,江蘇揚州225000;2.南京軍區(qū)軍事醫(yī)學研究所,江蘇南京210002)

S.suis 2溶血素SLY的分子克隆及溶血活性和免疫學特性研究

孫 雯1,潘秀珍2*

(1.揚州市職業(yè)大學醫(yī)學院,江蘇揚州225000;2.南京軍區(qū)軍事醫(yī)學研究所,江蘇南京210002)

目的 克隆并表達豬鏈球菌2型(S.suis 2)溶血素重組蛋白SLY,對其溶血活性及免疫學特性進行研究,為探討SLY在S.suis 2感染中的致病機理及篩選有效的疫苗預防和控制豬鏈球菌病奠定基礎。方法 對S.suis 2 05ZYH33全基因序列進行生物信息學分析,構建p ET32a-sly原核表達質粒并誘導表達出S.suis 2重組溶血素SLY蛋白;采用高濃度尿素裂解包涵體和His-Tag親和層析對重組SLY蛋白進行純化并復性;免疫保護實驗檢驗SLY的免疫保護作用。結果 SDS-PAGE顯示70 kD的SLY蛋白條帶;重組SLY蛋白具有溶血活性并受多種因素的影響;SLY對感染S.suis 2的Balb/c小鼠有一定的免疫保護作用。結論 優(yōu)化原核表達體系可以有效提高SLY蛋白的表達量,經(jīng)提純并復性的重組SLY具有較高的溶血價,為進一步純化及分析SLY蛋白的特性提供了必要的前提。

豬鏈球菌2型(S.suis 2);溶血素SLY;包涵體;溶血活性

豬鏈球菌(Streptococcus suis,S.suis)是人獸共患病的病原菌,有35個血清型。迄今,豬鏈球菌2型(S.suis 2)先后在20多個國家及地區(qū)引起多起人感染豬鏈球菌的惡性事件,被認為毒力最強,主要引起的疾病包括敗血癥、腦膜炎以及突發(fā)性死亡等[1]。在中國,1998年江蘇省和2005年的四川省曾暴發(fā)了大規(guī)模的人感染S.suis 2公共衛(wèi)生事件,患者出現(xiàn)了極其罕見的中毒性休克綜合征(STSS)。此后,人感染S.suis 2的散發(fā)疫情時有發(fā)生,近年呈現(xiàn)明顯上升趨勢,引起了公共衛(wèi)生領域的廣泛關注[2-3]。

目前,關于S.suis 2致病的具體機制知之甚少,主要集中在毒力因子的研究,例如溶血素(SLY)、莢膜多糖(CPS)、溶菌酶釋放蛋白(MRP)及胞外因子(EF)等。當前,研究者[1]普遍認為溶血素SLY是S. suis 2的一個重要毒力相關因子。研究的初步結果顯示,引起我國STSS疫情的S.suis 2的強毒株05ZYH33在體外條件下表現(xiàn)出高的溶血活性。溶血素(SLY)作為S.suis 2的一種分泌性蛋白質,能夠分泌于細菌的培養(yǎng)上清中,引起人喉癌上皮細胞(HEp-2)的裂解,SLY抗體可抑制這種作用。研究[4]還發(fā)現(xiàn)SLY陽性的S.suis 2菌株能黏附腦微細血管內皮細胞、巨噬細胞及上皮細胞,并導致所黏附細胞的裂解。相反,不產(chǎn)生SLY的S.suis 2突變株則喪失了溶血性以及對小鼠的毒力[5],這表明SLY在S.suis 2侵襲和裂解細胞的過程中發(fā)揮著關鍵的作用。因此,對于SLY與S.suis 2致病性之間關系的深入探討,既有助于進一步了解S.suis 2的致病機制,同時對于開發(fā)有效的S.suis 2免疫學檢測方法、篩選更有效的疫苗也奠定了基礎。

鑒于S.suis 2細菌培養(yǎng)上清中的SLY蛋白含量低且提純困難,我們構建了中國強毒株S.suis 2 05ZYH33 SLY蛋白的基因工程菌,通過分子克隆和蛋白表達獲得純度高且具有生物學活性的SLY融合蛋白,進一步對SLY進行了溶血活性的檢測和免疫學特性的分析與研究,為深入探討SLY在S.suis 2感染過程中的致病機理及篩選有效的疫苗來預防和控制豬鏈球菌病提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株S.suis 2 05ZYH33(分離自四川省資陽市的中毒性休克綜合征患者);質粒p ET32a及其宿主菌E.coli DH5α、E.coli BL21(實驗室保存);質粒p MD-18T、DNA膠回收試劑盒、PCR擴增試劑盒、限制性內切酶Sal I和Bam H I、T4連接酶(日本Ta KaRa公司產(chǎn)品);DNA Marker和蛋白Marker (深圳晶美生物工程有限公司產(chǎn)品);SPF級Balb/c小鼠(購自北京)。

1.2 方法

1.2.1 分子克隆溶血素基因 利用BLAST和Clustal W程序篩選實驗室保存的S.suis 2 05ZYH33菌株全基因組序列中可能存在的溶血素編碼序列(sly),設計引物,進行PCR擴增。5′端引物的序列:5’-CAC GGATCCATGAGAAAAAGT TCGCAC-3’,畫線部分為限制性內切酶Bam H I酶切位點;3′端引物的序列:5’-CG GTCGAC TTACTCTATCACCTCATCCGCA-3’,畫線部分為限制性內切酶Sal I酶切位點。引物由上?；瞪锕竞铣伞CR程序反應體系:95℃,5 min; 95℃,40 s;56℃,1 min;72℃,1 min;共30個循環(huán),最后72℃延伸10 min。

1.2.2 構建重組質粒p MD-18T-sly PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段,將片段克隆于p MD-18T載體中,轉化至感受態(tài)E.coli DH5α細菌。通過限制性內切酶Bam H I和Sal I雙酶切篩選并鑒定陽性轉化子,送往上海英駿生物技術有限公司進行DNA序列測定,并驗證其閱讀框。雙酶切體系為:10×T Buffer 1.5μL,p MD-18T-sly質粒2μL,Bam H I 0.5μL,Sal I 0.5μL,dd H2O 5.5μL,37℃水浴6 h。

1.2.3 構建重組表達質粒p ET32-sly 質粒p MD-18T-sly和p ET32a載體經(jīng)Bam H I、Sal I雙酶切的產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收后,經(jīng)T4 DNA ligase連接后克隆至感受態(tài)E.coli BL21細菌,構建重組原核表達載體p ET32-sly。菌液經(jīng)PCR檢測為陽性者進行質粒提取,酶切,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 優(yōu)化重組蛋白表達的時間 重組菌在37℃下分別誘導2、3、4、5 h,超聲波裂解,12 000 r/min離心10 min,用120 g/L SDS-PAGE電泳鑒定誘導的效果,選取最佳誘導時間。

1.2.5 分析重組蛋白的可溶性 重組菌在37℃下培養(yǎng)3 h后,OD達0.6,此時加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導至最佳誘導時間,進行超聲波裂解,12 000 r/min離心10 min,分別取裂解上清液和沉淀,用120 g/L SDS-PAGE電泳對重組蛋白進行定位分析。

1.2.6 優(yōu)化重組蛋白表達的培養(yǎng)溫度 選取28℃和37℃對重組菌進行誘導培養(yǎng),誘導至最佳誘導時間,分別取沉淀、上清進行120 g/L SDS-PAGE電泳鑒定誘導的效果,比較在28℃和37℃溫度下蛋白的表達量,從而選取最佳的誘導溫度。

1.2.7 純化和復性重組蛋白 洗滌包涵體:收集重組菌液,緩沖液Buffer A(20 mmol/L p H 7.5的Tris HCl,10 mmol/L Triton X-100,10 mmol/L EDTA)重懸,超聲波裂解30 min后10 000 g離心20 min,收集包涵體,用上述緩沖液洗2次。溶解包涵體:以每克包涵體加入5 m L緩沖液Buffer B (8 mol/L尿素,0.01 mol/L Tris HCl,0.1 mol/L Na H2PO4,p H 8.0),再加入終濃度體積分數(shù)為0.1%的β-巰基乙醇,4℃下裂解過夜。純化重組蛋白:包涵體裂解液經(jīng)0.22μm濾膜過濾后與1 m L Ni2NTA His Bind Resins置搖床培養(yǎng)1 h,裝入空層析柱中,用緩沖液B平衡層析柱,然后用緩沖液C (8 mol/L尿素,10 mmol/L Tris-Hcl,100 mmol/L Na H2PO4·2H2O,p H 6.3)洗脫非特異性結合在柱子上的蛋白質,最后用緩沖液D(8 mol/L尿素, 10 mmol/L Tris Hcl,100 mmol/L Na H2PO4· 2H2O,p H 4.5)洗脫吸附在柱子上的融合蛋白,采用120 g/L SDS-PAGE電泳對不同收集管中洗脫的目的蛋白含量進行分析。復性重組蛋白:用300 m L復性液A(2 mol/L尿素,1 mmol/L還原型谷胱甘肽,20 mmol/L Tris HCl,0.2 mmol/L氧化型谷胱甘肽,p H 8.0)4℃下透析12 h,期間換液2次,之后用300 m L復性液B(0.5 mol/L尿素,1 mmol/L還原型谷胱甘肽,20 mmol/L Tris HCl,0.2 mmol/L氧化型谷胱甘肽)繼續(xù)透析12 h,期間換液2次,再用10 mmol/L Tris HCl(p H 8.0)300 m L透析3 h以上,最后用去離子水繼續(xù)透析3 h以上。

1.2.8 鑒定重組蛋白的溶血活性 測定溶血價:在96孔細胞培養(yǎng)板中加入2%人紅細胞(150μL/孔),再加入等體積的復性重組蛋白(經(jīng)生理鹽水倍比稀釋),置37℃下作用2 h,100 g離心2 min后取上清液,分光光度計540 nm下測定其吸光值,以紅細胞與等體積生理鹽水共同孵育的孔作為陰性對照;能夠導致50%紅細胞溶解的待測樣品的最高稀釋倍數(shù)即為重組蛋白SLY所含的溶血單位數(shù)(即SLY的溶血價)。熱敏感性實驗:將-20℃保存的重組蛋白SLY分別置4℃、37℃、65℃溫度下處理20 min后,對溶血價進行測定?；罨鸵种茖嶒?在適當稀釋的重組蛋白SLY中分別加入二硫蘇糖醇(DTT)、氧化劑過氧化氫、β-巰基乙醇、抑制劑蛋白酶K,使之終濃度分別為5 mmol/L、體積分數(shù)0.1%、體積分數(shù)0.1%、100 mg/L,置室溫20 min,測定溶血價。活性保存實驗:分別經(jīng)抑制劑蛋白酶K、65℃及氧化劑過氧化氫處理后的重組蛋白SLY蛋白樣品另加入體積分數(shù)為2%β-巰基乙醇作用20 min,測溶血價。

1.2.9 動物保護實驗 將4周齡的20只Balb/c小鼠,分為實驗組和對照組,每組各10只。在接種S. suis 2 05ZHH33菌株之前,實驗組小鼠先進行SLY蛋白免疫。具體步驟為每只小鼠皮下注射用福氏完全佐劑乳化的25 mg/L SLY蛋白100μL;兩周后,每只小鼠皮下注射用福氏不完全佐劑乳化的25 mg/L SLY蛋白100μL;一周后,每只小鼠皮下注射用福氏不完全佐劑乳化的25 mg/L SLY蛋白100μL。實驗組小鼠進行SLY蛋白免疫期間,對照組小鼠則同步注射PBS。一周后,空白組和實驗組小鼠均腹腔注射1×108CFU/m L S.suis 2 05ZYH33各1 m L。

2 結果

2.1 構建并鑒定重組質粒p MD-18T-sly和p ET32a-sly

構建重組質粒p MD-18T-sly,將目的片段sly連接到表達載體pET32a中。重組表達載體pET32a-sly經(jīng)Bam H I、Sal I雙酶切后,經(jīng)10 g/L瓊脂糖電泳顯示S.suis 2中sly片段全長約為1 500 bp,與預期長度一致。DNA序列測定顯示該sly片段長度為1 491 bp,共編碼497個氨基酸。見圖1。

圖1 重組質粒p ET32a-sly雙酶切鑒定1:1 000 bp DNA marker;2、3:質粒p ET32a-sly; 4:Bam H I單酶切;5:Bam H I、Sal I雙酶切;6:PCR。

2.2 IPTG誘導培養(yǎng)時間對SLY表達的影響

為比較不同誘導時間下SLY表達量的區(qū)別,在37℃下分別用IPTG對重組菌誘導2、3、4、5 h,取誘導產(chǎn)物進行120 g/L SDS-PAGE鑒定分析。結果顯示,IPTG誘導培養(yǎng)達4 h時重組菌中SLY表達量最高。見圖2。

2.3 分析重組蛋白的可溶性

重組菌在37℃下培養(yǎng)至最佳誘導時間4 h,超聲波裂解誘導物,經(jīng)離心后獲取裂解上清液及沉淀,120 g/L SDS-PAGE電泳鑒定分析,發(fā)現(xiàn)表達產(chǎn)物主 要存在于包涵體中。見圖3。

圖2 不同誘導時間表達產(chǎn)物的SDS-PAGE結果1:蛋白Marker;2:p ET32a-sly/BL21; 3:未誘導重組菌裂解蛋白; 4～7:分別誘導2、3、4、5 h的表達產(chǎn)物。

圖3 超聲波裂解蛋白的SDS-PAGE1:蛋白質marker;2:BL21全菌裂解蛋白;3:p ET32a-sly/BL21; 4:未誘導重組菌裂解蛋白;5:誘導4 h的表達產(chǎn)物; 6:重組菌超聲破碎裂解上清蛋白;7:裂解沉淀(包涵體蛋白)。

2.4 不同培養(yǎng)溫度對SLY表達的影響

為進一步比較不同培養(yǎng)溫度對SLY表達的影響,重組菌分別采用28℃和37℃的培養(yǎng)溫度培養(yǎng)至最佳誘導時間4 h,比較重組菌SLY表達量的不同。120 g/L SDS-PAGE結果顯示,在28℃和37℃不同培養(yǎng)溫度條件下,可溶性SLY表達量均較低,主要以包涵體的形式存在,以37℃包涵體蛋白量較高。見圖4。

2.5 提純重組蛋白

對以包涵體形式存在的重組蛋白SLY提純并復性,經(jīng)120 g/L SDS-PAGE電泳后顯示獲得了唯一條帶的純化蛋白。見圖5。

圖4 溫度對SLY蛋白表達的影響1:蛋白質marker;2:BL21全菌裂解蛋白; 3:p ET32a;4:未誘導重組菌裂解蛋白; 5:28℃誘導4 h的上清;6:28℃誘導4 h的包涵體; 7:37℃誘導4 h的上清;8:37℃誘導4 h的包涵體。

圖5 純化的包涵體的SDS-PAGE1:蛋白標記;2:重組蛋白SLY包涵體在SDS-PAGE上的條帶。

2.6 重組蛋白的溶血活性

2.6.1 測定溶血價 測定SLY溶血價為210,隨著蛋白稀釋度的增大,溶血活力呈現(xiàn)逐步下降的趨勢。說明重組蛋白SLY具有明顯的裂解紅細胞的能力。2.6.2 熱敏感和活性不可逆恢復 培養(yǎng)的溫度對重組SLY的溶血價有顯著的影響,表現(xiàn)為37℃時溶血價最高;65℃處理20 min,溶血價則顯著的降低; 65℃處理后即使加入β-巰基乙醇或DTT室溫作用30 min,仍沒有顯示活性。見圖6。

2.6.3 活性的丟失與可逆恢復 SLY在氧化物過氧化氫和抑制劑蛋白酶K的 作用下,溶血價明顯的下降;加入β-巰基乙醇或DTT室溫作用30min后,丟失的活性可基本恢復。見圖6。

2.7 動物保護實驗

注射SLY的Balb/c小鼠作為實驗組,注射PBS的Balb/c小鼠作為對照組。給2組小鼠注射相同劑量的S.suis 2 05ZYH33細菌,監(jiān)控48 h,對死亡的小鼠數(shù)量進行記數(shù)。在接種1×108CFU/m L S.suis 2 05ZYH33菌株第2天,對照組10只小鼠全部死亡,實驗組小鼠狀態(tài)良好。實驗結果顯示,SLY對感染S.suis 2的Balb/c小鼠有一定的免疫保護作用。見圖7。

圖6 溶血活性實驗1:4℃處理;2:37℃處理;3:65℃處理; 4:65℃處理后加β-巰基乙醇;5:雙氧水處理; 6:雙氧水處理后加β-巰基乙醇;7:蛋白酶K處理; 8:蛋白酶K處理后加β-巰基乙醇;9:空白對照。

圖7 SLY免疫保護實驗

3 討論

溶血素是細菌中十分常見的毒力因子,如A群鏈球菌的O溶血素、嗜水氣單胞菌的HEC毒素以及單核細胞李氏桿菌的溶血素[6]。近幾年,美國、新西蘭和加拿大等多個研究小組對S.suis 2 SLY進行了深入的研究。溶血素SLY分泌于上清中,屬于硫醇激活的穿毒素家族,同時是一種膽固醇結合類細胞毒素[7],有利于其攻擊膜上具有膽固醇的真核細胞。實驗[8-9]證明,S.suis 2的SLY對人紅細胞最為敏感,SLY陽性菌株上清及純化的SLY均具有細胞毒性作用,經(jīng)游離的膽固醇預處理抑制其毒性作用,進一步在細胞水平證明了SLY在致病過程中發(fā)揮的重要作用。豬鏈球菌的SLY能增強細菌接觸上皮細胞和內皮細胞的能力,同時刺激機體產(chǎn)生免疫反應,如刺激人內皮細胞產(chǎn)生IL-6、IL-8和MCP-1等細胞因子,它們可調整血腦屏障的完整性和通透性以利于豬鏈球菌在血液中傳播和穿過血腦屏障[10]。應用S.suis 2江蘇分離株HA9801所產(chǎn)生的SLY進行實驗,不僅能引致Vero細胞發(fā)生病變,還能致死豚鼠[11]。這些研究結果均表明SLY在致病的過程中扮演著重要的角色。

我們的研究從S.suis 2中國強毒株05ZYH33中克隆sly基因進行原核表達,并通過親和層析純化獲得重組蛋白。研究表明,溫度對SLY表達量的高低有重要影響,較高誘導溫度常常會使一些蛋白累積形成包涵體,并且由于表達的SLY有毒性,高溫誘導時往往會導致表達菌停止生長甚至死亡。但考慮到37℃誘導溫度下包涵體蛋白量較低溫誘導下可溶性蛋白量甚多且純度較高,所以實驗選用37℃作為誘導溫度。同時發(fā)現(xiàn),IPTG誘導蛋白表達的最適宜時間為4 h,誘導時間過長和過短都會影響蛋白的積累量。通過優(yōu)化原核表達體系可以有效提高SLY蛋白的表達量,這為進一步研究SLY蛋白的特性提供了必要的前提條件。通過檢測SLY的活性,發(fā)現(xiàn)經(jīng)提純并復性的重組SLY具有較高的溶血價,進一步發(fā)現(xiàn)SLY蛋白在高溫作用下極易失活,并且是不可逆的,氧化劑和蛋白酶K可完全抑制其活性,但只是一種可逆失活,加入還原劑,活性可恢復,這為純化該毒素提供了技術手段。免疫保護實驗顯示,SLY對感染S.suis 2的Balb/c小鼠有一定的免疫保護作用,SLY有可能作為豬鏈球菌疫苗的候選分子。

SLY在S.suis 2侵襲宿主的過程中如何發(fā)揮重要的角色及如何引起宿主細胞病變的問題將有待進一步探討。我們的研究結果,為進一步探索S.suis 2在感染宿主過程中的致病機理、建立快速可靠的免疫學檢測方法及開發(fā)有效預防豬鏈球菌病的疫苗提供了思路,對于本病的早期診斷、流行病學監(jiān)測、預警和疾病防控具有重要的意義。

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[責任編輯 姬 荷]

Molecular Cloning，Hemolytic activity，and Immunological characterization of Suilysin from S.suis 2

SUN Wen1，PAN Xiuzhen2*
（1.Medical College of Yangzhou Vocational University，Yangzhou，Jiangsu 225127 China；2.Institute of Military Medical Sciences，Nanjing Command，Nanjing Jiangsu 210002，China）

Objective To understand Streptococcus suis serotype 2（S.suis 2）suilysin（SLY）display which function in the severe infection of S.suis 2 and identify vaccine candidates，molecular cloned and analyzed hemolytic activity and immunological characterization of SLY.Methods Bioinformatics was adopted to analyze the whole genome sequence of the Chinese strain 05ZYH33 of S.suis 2.A recombinant plasmid p ET32a-sly carrying sly gene was developed and transformed into prokaryotic expression host BL21（DE3）strain.Using chelating chromatography to purify SLY.Immunity test was used to test the immune protective effect of SLY.Results Protein expression analysis showed that a 70 k D protein can be observed in SDS-PAGE.After being purified by chelating chromatography，SLY showed clear hemolytic activity and affected by many factors.In an animal model system，we demonstrated that the mice immunized with SLY become to be protected against lethal doses of bacteria.Conclusion Successfully constructed prokaryotic expression system，SLY showed clear hemolytic activity which would be useful for future research on function of SLY.Animal model system means the successful application of proteomics may as a technique for identifying vaccine candidates.

Streptococcus suis 2（S.suis 2，SS2）；Suilysin（SLY）；inclusion body；hemolytic activity

R392.1

A

1672-7606(2014)03-0179-06

2014-04-30

國家自然科學基金項目(30670105、30600533);國家863項目(2006AA0Z455)。

孫雯(1983—),女,江蘇揚州人,講師,從事微生物學及免疫學的教學與科研工作。

*通訊作者:潘秀珍(1963—),女,江蘇南京人,研究員,碩士生導師,從事流行病學的科研工作。