衛(wèi)文強(qiáng),邢偉偉,于運(yùn)運(yùn),朱欣茹,房 娜,王風(fēng)玲,季少平

(河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院,河南開(kāi)封475004)

一株耐鹽葡萄球菌的分離與鑒定

衛(wèi)文強(qiáng),邢偉偉,于運(yùn)運(yùn),朱欣茹,房 娜,王風(fēng)玲,季少平*

(河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院,河南開(kāi)封475004)

目的 從鹽堿地土壤中分離耐鹽耐藥細(xì)菌。方法 采用倍比稀釋法從土壤中分離不同性狀的細(xì)菌,分別對(duì)這些細(xì)菌進(jìn)行耐鹽性實(shí)驗(yàn),將篩選到耐150 g/L NaCl的菌株進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)、藥敏實(shí)驗(yàn)和16sRNA序列分析。結(jié)果16sRNA分析表明從土壤中分離到一株耐鹽表皮葡萄球菌,能分解乳糖和蔗糖,可在150 g/L NaCl中生長(zhǎng),該菌株對(duì)青霉素和苯唑西林耐藥。結(jié)論 該耐鹽葡萄球菌株的分離將為耐鹽基因的克隆及轉(zhuǎn)基因耐鹽菌株的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

葡萄球菌;耐鹽;16sRNA;鑒定

醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域高鹽廢水的排放,給環(huán)境帶來(lái)一定的污染,耐鹽細(xì)菌在高鹽廢水的治理方面能發(fā)揮積極的作用。開(kāi)封地區(qū)地處豫東大平原,屬于鹽堿土壤[1]。為了挖掘該地區(qū)的耐鹽微生物資源,我們從土壤中分離菌株,篩選到一株耐鹽表皮葡萄球菌,并對(duì)其生理特性進(jìn)行了分析。我們的研究將為耐鹽基因的克隆和轉(zhuǎn)基因耐鹽菌株的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

普通肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星生物公司);抗生素藥敏紙片及含糖生化培養(yǎng)基(杭州天和微生物試劑公司);Taq酶(日本Ta KaRa公司);MarkerⅢ(上海萊楓生物公司)。

1.2 土壤菌群的分離

土樣取自河南大學(xué)金明校區(qū)校園附近,用無(wú)菌蒸餾水將土樣倍比稀釋。用移液器分別吸取10-2、10-3、10-43個(gè)梯度的菌液各0.1 m L,用無(wú)菌三角涂棒均勻涂布在肉湯瓊脂固體培養(yǎng)基表面,置37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察菌落的生成情況。再將不同特征的菌落畫線分離,進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.3 耐鹽性實(shí)驗(yàn)

分別取單個(gè)菌落置肉湯培養(yǎng)基37℃過(guò)夜培養(yǎng),供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。用無(wú)菌蒸餾水配置5、50、100、150、200、250 g/L的氯化鈉肉湯培養(yǎng)基,將培養(yǎng)基分別加入離心管中,隨后加入10μL菌液,置37℃培養(yǎng)箱,靜置培養(yǎng)24～48 h,觀察培養(yǎng)基的變化情況。同時(shí)設(shè)Top10細(xì)菌作為不耐鹽的陰性對(duì)照。

1.4 生化實(shí)驗(yàn)

取耐鹽菌株的菌液5μL接種到含葡萄糖、蔗糖、乳糖等成分的培養(yǎng)基,置37℃培養(yǎng)箱,靜置培養(yǎng)24 h。觀察培養(yǎng)基顏色的變化。

1.5 藥敏實(shí)驗(yàn)

取耐鹽菌株的菌液100μL涂布到肉湯瓊脂固體培養(yǎng)基,用無(wú)菌鑷子夾取含青霉素、慶大霉素、阿米卡星、復(fù)方磺胺甲基異噁唑、環(huán)丙沙星、苯唑西林抗生素的藥敏紙片,輕置培養(yǎng)基表面,再倒置37℃培養(yǎng)箱,培養(yǎng)24 h。每個(gè)抗生素設(shè)3個(gè)重復(fù)。用直尺量取抑菌圈直徑。

1.6 16sRNA分析

取耐鹽菌株的菌液3 m L,用酚、氯仿抽提基因組備用。以基因組為模板,用合成的16sRNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物為:16sRNA-F(8～27): 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;反向引物為:16sRNA-R(1 510～1 492):5′-GGTTACCT TGTTACGACACGACTT-3′;由上海生工公司合成。擴(kuò)增體系為:94℃,5 min;94℃,5 min;53℃, 45 s;72℃,1 min 30 s;30個(gè)循環(huán);72℃,10 min; 10℃,10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行80 g/L瓊脂糖凝膠電泳。從凝膠上切下預(yù)期大小條帶,然后用膠回收試劑盒進(jìn)行純化,直接送純化的PCR產(chǎn)物到生工公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入到NCBI進(jìn)行BLAST序列比對(duì),確定耐鹽菌株的分類。

2 結(jié)果

2.1 從土壤中分離菌群

將土壤用水稀釋后涂布到肉湯瓊脂固體培養(yǎng)基,在平板上長(zhǎng)了不同顏色(白色、紅色、米黃色、灰色等)和性狀(如邊緣光滑、表面粗糙等)的菌落。將每種菌落分別畫線到一個(gè)肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板上,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 耐鹽性分析

將分離的菌落接種到不用濃度氯化鈉的肉湯培養(yǎng)基中,連續(xù)培養(yǎng)24 h,觀察到4號(hào)菌在150 g/L氯化鈉肉湯培養(yǎng)基中仍能生長(zhǎng),其培養(yǎng)基變渾濁,管底有白色沉淀生成(圖1a)。4號(hào)菌的菌落特征為顏色淺黃色、表面光滑、濕潤(rùn)(圖1b)。耐鹽性實(shí)驗(yàn)說(shuō)明該菌株具有耐鹽的性質(zhì)。

2.3 生化分析

將分離的耐鹽菌株分別接種到含糖培養(yǎng)基中, 24 h后觀察到含有乳糖和蔗糖的培養(yǎng)基變渾濁、顏色變黃。但放有葡萄糖的培養(yǎng)基顏色沒(méi)有變化。說(shuō)明該菌具有分解乳糖和蔗糖的能力。

2.4 耐藥性分析

為了確定分離耐鹽菌是否有耐藥性,我們來(lái)用不同種類的抗生素進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,該菌對(duì)青霉素和苯唑西林高度耐藥,對(duì)環(huán)丙沙星最敏感,其次為復(fù)方磺胺甲基異噁唑、慶大霉素、阿米卡星。抑菌圈直徑見(jiàn)表1。

2.5 16sRNA分析

為了最終確定所分離菌落的種屬,我們用16sRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到一條1.4 kb的預(yù)期條帶,而陰性對(duì)照(NC)則沒(méi)有條帶擴(kuò)增(圖2)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果放到NCBI進(jìn)行BLAST。結(jié)果表明,分離的菌落與表皮葡萄球菌的同源性最高,達(dá)98%。

圖1 耐鹽菌株的分離a:150 g/L NaCl的肉湯培養(yǎng)基中耐鹽菌的生長(zhǎng); b:耐鹽菌在肉湯瓊脂固體培養(yǎng)基的菌落特征。

表1 耐鹽菌株的耐藥性(mm)

圖2 耐鹽菌株的16sRNA序列

3 討論

根據(jù)細(xì)菌的菌落特征,結(jié)合耐鹽性、耐藥性、生化實(shí)驗(yàn)、16sRNA序列分析,確定所分離的耐鹽菌株屬于表皮葡萄球菌。該耐鹽菌株能在150 g/L NaCl中生長(zhǎng),可能是其在豫東平原鹽堿土壤中長(zhǎng)期適應(yīng)性進(jìn)化的結(jié)果[2]。此類細(xì)菌不僅在鹽堿土壤中存在,在海洋中也有發(fā)現(xiàn),汪長(zhǎng)東等[3]在舟山深海的海泥中分離到一株與表皮葡萄球菌有99%相似性的耐鹽菌。說(shuō)明了這類菌株在自然界的廣泛存在。

Hasnain等[4]從耐鹽細(xì)菌中分離到了耐鹽相關(guān)的質(zhì)粒。為了探討所分離耐鹽菌株耐鹽的機(jī)制,我們?cè)噲D從菌體中分離質(zhì)粒,但沒(méi)有分離到,推測(cè)耐鹽基因可能在細(xì)菌的基因組上。后續(xù)工作可以從這株耐鹽菌株基因組中擴(kuò)增耐鹽基因,利用耐鹽基因構(gòu)建帶有耐鹽基因的菌株,用于醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域高鹽廢水的處理,以減輕廢水對(duì)環(huán)境的污染[5]。

人類和動(dòng)物病原菌的耐藥性問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重,土壤細(xì)菌的耐藥性也逐漸引起了人們的注意。我們的研究顯示,土壤中所分離的耐鹽菌株對(duì)青霉素和苯唑西林存在很強(qiáng)的耐藥性。土壤耐鹽細(xì)菌也能產(chǎn)生耐藥性,可能是細(xì)菌長(zhǎng)期暴露于土壤中污染的抗生素或拮抗性微生物如鏈霉菌、放線菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)后,逐漸產(chǎn)生了耐藥性[6-8]。這提示人們?cè)谑褂每股氐倪^(guò)程中注意合理處理抗生素殘留,避免其流入環(huán)境中造成污染。

[1]楚純潔,劉清臻,馬建華.豫東平原鹽堿地土壤顆粒分形特征[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,(5):50-54.

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[3]汪長(zhǎng)東,陳鵬,閆旭,等.一株耐鹽細(xì)菌的16S r RNA基因序列分析[J].生物技術(shù)通報(bào),2008,(6):164-167.

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[責(zé)任編輯 姬 荷]

Isolation and identification of a halotolerant Staphylococcus strain

WEI Wenqiang，XING Weiwei，YU Yunyun，ZHU Xinru，F(xiàn)ANG Na，WANG Fengling，JI Shaoping*
（Medical college of Henan university，Kaifeng，Henan 475004，China）

Objective To isolate the halotolerant bacterium strain from eastern henan plain.Methods By culturing in different salt concentrations，one strain was isolated.The biochemical test，drug sensitive test，16sRNA sequence homology analysis were carried out to analyze the characterization of the halotolerant bacterium.Results The halotolerant bacterium was according to the 16sRNA results.The stain was resistant to penicillin and oxacillin. It could oxidize lactose and sucrose.Conclusion The isolation of the halotolerant bacterium would provide materia for the cloning of halotolerant gene and have an application in the transgenic salt-tolerant bacteria.

Staphylococcus；salt tolerance；16sRNA；appraisal

R378.1

A

1672-7606(2014)03-0185-03

2014-04-12

河南大學(xué)博士啟動(dòng)基金(132012106)。

衛(wèi)文強(qiáng)(1981-),男,河南洛陽(yáng)人,博士,副教授,從事微生物學(xué)的教學(xué)與科研工作。

*通訊作者:季少平(1965-),男,河南信陽(yáng)人,博士,碩士生導(dǎo)師,教授,從事生物化學(xué)的教學(xué)和科研工作。