劉 靜,陳寅生,李 靜,朱花蘭,叢 悅

(河南大學(xué)藥物研究所,河南開封475004)

功勞木有效成分的指紋圖譜及含量測(cè)定研究

劉 靜,陳寅生,李 靜,朱花蘭,叢 悅*

(河南大學(xué)藥物研究所,河南開封475004)

目的 立全面評(píng)價(jià)功勞木的高效液相指紋圖譜,為科學(xué)評(píng)價(jià)和有效控制質(zhì)量提供可靠方法。方法 采用高效液相色譜方法分析闊葉十大功勞和細(xì)葉十大功勞的生物堿成分和非生物堿成分指紋圖譜。結(jié)果 運(yùn)用指紋圖譜相似度軟件和系統(tǒng)聚類分析,確定了17個(gè)色譜峰為共有峰,其中指認(rèn)出6個(gè)峰,指紋圖譜相似度都在0.8以上。并測(cè)定了功勞木3個(gè)有效成分(藥根堿,巴馬亭,小檗堿)的含量,其回收率分別為97.83%,100.03%,100.08%和線性條件良好(r＞0.999 0)。結(jié)論本法簡(jiǎn)便,特征性強(qiáng),化學(xué)信息比較全面,可用于不同產(chǎn)地功勞木藥材的指紋圖譜鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)。

HPLC;指紋圖譜;定量分析;功勞木

功勞木系小檗科闊葉十大功勞Mahonia bealei (Fort)Carr.和細(xì)葉十大功勞Mahonia fortunei(Lindl.) Fedde的干燥莖,主要分布在中國(guó)南方地區(qū)。作為傳統(tǒng)中藥,功勞木主要用于治療發(fā)熱、腫脹、感染、痢疾[1]?，F(xiàn)在藥理研究證明功勞木具有抗微生物、抗腫瘤、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥、抗流感、抗感染、抗病毒等活性[2-8],其中所含的生物堿是有效成分之一[9]。此外,隨著對(duì)功勞木研究的進(jìn)一步深入,從功勞木中分離得到10個(gè)非生物堿成分,分別為酚酸類、苯丙素類以及腦苷類成分等[10-12]。這些成分具有顯著地逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥活性、抗氧化以及保肝的活性[13-17],并對(duì)其中活性最好的3,4,5-三甲氧基苯酚-1-O-β-D-葡萄糖苷(C1),erythrosyringoyl glycerol 8-O-β-D-glucoside(C2),5,5’-二甲氧基落葉松脂醇-4’-O-β-D-葡萄糖苷(C3)等成分進(jìn)行了含量測(cè)定[18]。盡管已有文獻(xiàn)報(bào)道功勞木指紋圖譜的研究[19,20],但是研究都側(cè)重于生物堿的指紋圖譜,忽略了對(duì)非生物堿成分部分的研究。所以,建立一個(gè)全面、系統(tǒng)的指紋圖譜是控制功勞木質(zhì)量必備條件。我們驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)14批不同地區(qū)的功勞木進(jìn)行指紋圖譜研究,同時(shí)指認(rèn)6個(gè)對(duì)照品,并對(duì)藥根堿、巴馬亭、小檗堿進(jìn)行含量測(cè)定,并探討該方法對(duì)生物堿溶出率的影響。該方法的建立將為整體控制功勞木質(zhì)量,完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器與藥劑

指紋圖譜分析軟件為國(guó)家藥典委員會(huì)的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004 A版)

對(duì)照品:C1—3,4,5-三甲氧基苯酚-1-O-β-D-葡萄糖苷;C2—erythrosyringoyl glycerol 8-O-β-D-glucoside;C3—5,5’-二甲氧基落葉松脂醇-4’-O-β-D-葡萄糖苷;C4—藥根堿;C5—巴馬亭;C6—小檗堿均為本實(shí)驗(yàn)室提純制得[10],經(jīng)鑒定其純度大于98%。儀器與試劑見表1。

表1 儀器與試劑列表

購(gòu)買不同產(chǎn)地的功勞木共14份,藥材樣品來(lái)源見表2,經(jīng)我校藥學(xué)院袁王俊副教授鑒定。

表2 不同產(chǎn)地功勞木樣品和相似度結(jié)果

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取化合物C1、C2、C3的對(duì)照品,用甲醇溶解,制成對(duì)照品母液。用吸量管吸取一定量體積的對(duì)照品母液分別放于5 m L容量瓶中,后過(guò)濾0.45μm濾膜,備用。

精密稱取化合物C4、C5、C6的對(duì)照品,用甲醇溶解,制成對(duì)照品母液。用吸量管吸取一定量體積的對(duì)照品母液分別放于5 m L容量瓶中,用甲醇定容,最終得到質(zhì)量濃度分別為0.3、0.125、0.20 mg/m L的混合對(duì)照品溶液,后過(guò)濾0.45μm濾膜,備用。

1.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取過(guò)3號(hào)篩的功勞木粉末1.0 g,加體積分?jǐn)?shù)70%甲醇8 m L,稱重,室溫下180 W40 Hz超聲30 min,放冷后稱重。用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇補(bǔ)足失重,過(guò)濾,濾液轉(zhuǎn)移至10 m L容量瓶,用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇稀釋至刻度,搖勻,后過(guò)濾0.45μm濾膜,備用。

1.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 通過(guò)紫外分光光度計(jì)對(duì)功勞木提取液進(jìn)行全波長(zhǎng)(190 nm～800 nm)掃描,結(jié)果顯示,在226 nm處有最大吸收。

1.2.4 HPLC分析條件 以乙腈(A)-50 mmol/L磷酸二氫鉀(p H=3,磷酸調(diào))(B)為流動(dòng)相,采用梯度洗脫程序分離,見表3;Cosmosil C18色譜柱(4.6 mm× 250 mm,5μm);柱溫25℃;檢測(cè)波長(zhǎng):226 nm;流速:1 m L/min;進(jìn)樣量10μL。

表3 梯度洗脫程序

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1 精密度試驗(yàn) 取功勞木樣品(S1)供試品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,以C4為參照峰計(jì)算共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。

1.2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取功勞木樣品(S1)供試品溶液,分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣,以C4為參照峰計(jì)算共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。

1.2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取功勞木樣品(S1)6份,按1.2.2項(xiàng)制備供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,以C4為參照峰計(jì)算共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。

1.2.5.4 線性關(guān)系考察 精密移取C4、C5、C6的對(duì)照品溶液,分別進(jìn)樣2、4、8、12、20、25μL在1.2.4項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定,以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.5 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知量的功勞木粉末(過(guò)3號(hào)篩)0.5 g各6份,分別精密加入C4、C5、C6對(duì)照品溶液,按1.2.2項(xiàng)制備供試品溶液,在1.2.4項(xiàng)色譜條件下測(cè)定。

1.3 樣品測(cè)定

取14批功勞木樣品,按1.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在1.2.4項(xiàng)下的色譜條件下依次進(jìn)樣檢測(cè),記錄色譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)方法考察結(jié)果

2.1.1 精密度試驗(yàn) 各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1.0%、相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%,符合指紋圖譜的要求。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1.0%、相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%,顯示樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定,符合指紋圖譜的要求。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) 各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1.0%、相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%,符合指紋圖譜的要求。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 C4回歸方程為Y=4 079.5X +86.828(r=0.999 4),線性范圍0.6～7.5μg;C5回歸方程為Y=4 292.8X-54.594(r=0.999 4),線性范圍0.25～3.13μg;C6回歸方程為Y=3 552.2X -62.778(r=0.999 8),線性范圍0.4～5.0μg。

2.1.5 回收率試驗(yàn) C4回收率為97.83%,RSD 2.53%;C5回收率為100.03%,RSD 2.60%;C6回收率為100.08%,RSD 2.81%。

2.2 樣品含量測(cè)定結(jié)果 14種不同產(chǎn)地的功勞木供試品溶液,測(cè)定結(jié)果見表4。功勞木色譜圖共獲得17個(gè)共有峰,指認(rèn)其中6個(gè)共有峰,分別為4號(hào)峰為C1, 7號(hào)峰為C2,9號(hào)峰為C3,14號(hào)峰為C4,16號(hào)峰為C5,17號(hào)峰為C6。典型的功勞木藥材色譜圖見圖1。

表4 不同產(chǎn)地功勞木中C4,C5,C6的含量測(cè)定(n=3)

圖1 功勞木(A)和6個(gè)對(duì)照品(B)的HPLC色譜圖

2.3 特征指紋圖譜的建立

2.3.1 參比峰的選擇 在各批次樣品圖譜中C4的色譜峰(14號(hào)峰)分離良好,峰位偏居中,峰面積大,且為所有樣品共有。所以,確定C4為參照峰。

2.3.2 特征指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 將14批功勞木藥材HPLC圖譜依次導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件,以S1批藥材譜圖作為參照譜進(jìn)行指紋匹配,確定了17個(gè)共有峰,“時(shí)間窗”寬度為0.5 min,經(jīng)校準(zhǔn)后,生成了共有模式見圖2,并進(jìn)行了相似度計(jì)算,14批樣品的相似度見表1。闊葉十大功勞樣品相似度均大于0.94,細(xì)葉十大功勞樣品相似度為0.84,不同品種來(lái)源的樣品之間有明顯差別。

2.4 系統(tǒng)聚類分析

應(yīng)用SPSS11.0軟件系統(tǒng)聚類法,以歐氏距離平方為測(cè)度,進(jìn)行聚類分析,聚類圖見圖3。結(jié)果表明,聚合距離為10時(shí),樣品分成兩大類,闊葉十大功勞樣品聚成一大類,細(xì)葉十大功勞樣品聚成一大類;聚合距離為5時(shí),闊葉十大功勞樣品分為兩類,其中來(lái)自浙江樣品歸為一類,其他產(chǎn)地樣品聚為一類。說(shuō)明來(lái)自浙江闊葉十大功勞與其他產(chǎn)地闊葉十大功勞有輕微差異。聲、回流2種不同提取方法的考察結(jié)果表明,2種提取方法提取效率相當(dāng),考慮到超聲操作較簡(jiǎn)便,故提取方法選擇超聲。對(duì)不同的提取時(shí)間15、30、45、60 min的考察結(jié)果表明30 min后各時(shí)間點(diǎn)的提取效率基本一致,故選擇超聲時(shí)間為30 min。所以確定用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇超聲30 min為提取方法。

圖3 聚類分析結(jié)果

我們實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙酸水、乙腈-乙酸水、甲醇-磷酸二氫鉀水、乙腈-磷酸二氫鉀水、甲醇-三乙胺水和乙腈-三乙胺水8種流動(dòng)相

圖2 14批功勞木樣品HPLC指紋圖譜

3 討論

提取溶劑的考察結(jié)果表明,在所比較的6種提取溶劑:甲醇、體積分?jǐn)?shù)50%甲醇、體積分?jǐn)?shù)70%甲醇、乙醇、體積分?jǐn)?shù)50%乙醇、體積分?jǐn)?shù)70%乙醇,以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇提取的樣品色譜峰個(gè)數(shù)較多,峰面積較大,故提取溶劑選擇體積分?jǐn)?shù)50%甲醇。對(duì)超系統(tǒng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用乙腈-磷酸二氫鉀水流動(dòng)相系統(tǒng),各峰的分離度較好,且基線平穩(wěn),有利于指紋圖譜的分析,因此最終采用乙腈-磷酸二氫鉀水系統(tǒng)作為流動(dòng)相系統(tǒng)。

相似度分析和聚類分析結(jié)果一致,表明功勞木不同品種之間在成分組成和含量上存在很大差異。功勞木在品質(zhì)特征方面呈現(xiàn)出一定的地域性及種屬性特征,來(lái)自同一省份的功勞木樣品的同源性較高。含量測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地為開封的細(xì)葉十大功勞中所含的生物堿C4和C6含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于闊葉十大功勞,浙江產(chǎn)地的闊葉十大功勞中所含的生物堿C5和C6的含量明顯高于其他產(chǎn)地,這些結(jié)果表明各成分含量的差異與各地域環(huán)境和品種來(lái)源有很大關(guān)系。由于該方法針對(duì)檢測(cè)功勞木中所有各類成分,所以生物堿的含量要比針對(duì)檢測(cè)生物堿方法得到的結(jié)果要低一些[21],但并不影響全面評(píng)價(jià)功勞木質(zhì)量的目的。所以,本法簡(jiǎn)便,特征性強(qiáng),化學(xué)信息比較全面,可用于不同產(chǎn)地、不同品種功勞木藥材的指紋圖譜鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)。

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[責(zé)任編輯 李武營(yíng)]

Quality assessment of Caulis Mahoniae by HPLC fingerprint and quantitative analysis

LIU Jing，CHEN Yinsheng，LI Jing，ZHU Hualan，CONG Yue*
（Institute of Pharmacy，Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China）

To establish a sensitive and specific HPLC method for quality control of Caulis Mahoniae.A validated reversed phase high performance liquid chromatographic method has been developed for chromatographic fingerprint analysis and for quantification of the three bioactive alkaloids：bererine，palmatine and jatrorrhizine. Chromatographic fingerprints were compared visually and analyzed using Similarity Evaluation System and Hierarchical Cluster Analysis.In the fingerprint analysis，17 chromatographic peaks were selected as characteristic peaks，of which 6 peaks were identified.The similarity of chromatographic fingerprints from the samples was over 0.8.In quantitative analysis，the recovery of the three bioactive alkaloids（jatrorrhizine，palmatine and bererine）was 97.83%，100.03%and 100.08%，respectively and good linearity（r＞0.999 0）was observed for the three compounds over a relatively wide range of concentrations.These results showed that the established method for fingerprinting and quantitative analysis was suitable for the quality control of Caulis Mahoniae.

HPLC；chromatographic fingerprint；quantitative analysis；Caulis Mahoniae

R927.2

A

1672-7606(2014)03-0170-05

2014-03-26

國(guó)家自然基金項(xiàng)目(21102035);河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(14A180030)。

劉靜(1986-),女,河北廊坊人,碩士研究生,從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究工作。

*通訊作者:叢悅(1978-),女,遼寧遼陽(yáng)人,博士,副教授,從事中藥化學(xué)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作。