林金鑾 王發(fā)圣 葉君健 吳朝陽(yáng) 李 祥 林建華

miR-17-92基因簇在骨肉瘤中的表達(dá)及其臨床意義*

林金鑾①王發(fā)圣①葉君?、賲浅?yáng)①李 祥②林建華①

目的：探討人骨肉瘤組織和鄰近正常骨組織中miR-17-92基因簇的表達(dá)情況及其臨床意義。方法：運(yùn)用Q-PCR法檢測(cè)63例骨肉瘤組織及鄰近部位正常骨組織中miR-17-92基因簇的表達(dá)水平，并分析miR-17-92基因簇表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：miR-17-92在所有組織中均有表達(dá)，且在腫瘤組織中表達(dá)明顯高于在正常組織中的表達(dá)（P＜0.05），另外，miR-17-92基因簇高表達(dá)患者預(yù)后更差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.027）。結(jié)論：miR-17-92基因簇在骨肉瘤組織和鄰近正常骨組織中表達(dá)存在差異性，可能在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用，有望成為骨肉瘤患者預(yù)后一種新的指標(biāo)。

miR-17-92基因簇 骨肉瘤 預(yù)后

骨肉瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年，惡性程度高，進(jìn)展迅速，預(yù)后差［1］。近年研究表明microRNA（miRNA）作為癌基因或抑癌基因廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，不同腫瘤組織miRNA表達(dá)譜不同，腫瘤組織中miRNA的表達(dá)可能成為新的腫瘤標(biāo)志。其中，miR-17-92是一個(gè)典型的多順?lè)醋觤iRNA基因簇。在人類基因組中，miR-17-92位于染色體13q31.3上一個(gè)約長(zhǎng)7kb的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本C13orf25的第3個(gè)內(nèi)含子上。此編碼含有6個(gè)成熟的miRNA（miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1）［2］。大量研究表明，miR-17-92基因簇在多種實(shí)體瘤中表達(dá)明顯上調(diào)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［3］。本研究采用Q-PCR方法檢測(cè)miR-17-92基因簇在骨肉瘤組織和鄰近正常骨組織中的表達(dá)，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 組織來(lái)源及試劑材料

1.1.1 組織來(lái)源 收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科2007年1月至2013年9月經(jīng)手術(shù)切除或者活檢取得的63例骨肉瘤組織和鄰近正常骨組織標(biāo)本，所有標(biāo)本均由本院病理科醫(yī)生確診為骨肉瘤。臨床病理信息由患者的病歷和病理報(bào)告獲得。其中男性33例，女性30例；年齡6～56歲，平均年齡17.08±13.12歲；Enneking外科分期：Ⅰ期8例，ⅡA期24例，ⅡB期26例，Ⅲ期5例；組織學(xué)類型：普通型（包括成骨細(xì)胞型、成軟骨細(xì)胞型、成纖維細(xì)胞型等）47例，小細(xì)胞型6例，毛細(xì)血管擴(kuò)張型5例，其他類型（骨旁骨肉瘤、未分化型骨肉瘤）5例；骨肉瘤生長(zhǎng)部位：股骨34例，脛骨19例，其他部位（包括肱骨等）10例。所有患者均獲隨訪，隨訪從開(kāi)始手術(shù)至2014年3月，時(shí)間1～68個(gè)月，平均時(shí)間30.89+26.89個(gè)月。

1.1.2 主要儀器 LDZ5-2型常溫臺(tái)式離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；Biofuge Stratos高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Heraeus公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴箱（常州國(guó)華電器公司）；Thermo Forme925型超低溫冰箱（美國(guó)Thermo公司）；PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Beckman公司）；ABI7500熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

1.1.3 主要試劑 Trizol裂解液（美國(guó)Invotrogen公司）；miRNA分離試劑盒（美國(guó)Invotrogen公司）；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)ABI公司）；miR-17-92基因簇引物序列F：5'-CTGTCGCCCAATCAAACTG-3'；R：5'-GTCACAATCCCCACCAAAC-3'）［4］，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及Q-PCR檢測(cè) 組織樣本在液氮中研碎，采用TaqMan miRNA Isolation Kit提取總RNA，應(yīng)用TaqMan microRNA assay和TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為：在20 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；然后將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA稀釋后，取稀釋的cDNA 2 μL與2 μL Taq-Man引物混合，在20 μL反應(yīng)體系中，95℃10 min變性，隨后95℃15 s，60℃60 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.2 miR-17-92基因簇表達(dá)量計(jì)算方法 實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用相對(duì)定量法：miR-17-92基因簇表達(dá)以U6作為內(nèi)參照，空白對(duì)照為基準(zhǔn)，待測(cè)樣品相對(duì)值=（2-△△Ct）的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，其中△Ct=（目的基因Ct-內(nèi)參Ct）的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；△△Ct=（待測(cè)樣品中目的基因△Ct-參照樣品中目的基因△Ct）的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier生存分析，Log-Rank檢驗(yàn)不同miR-17-92基因簇表達(dá)組間生存率的比較，用Cox模型對(duì)生存資料進(jìn)行單因素及多因素分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-17-92基因簇在骨肉瘤組織及相鄰正常骨組織中的表達(dá)

Q-PCR結(jié)果表明63例骨肉瘤組織miR-17-92基因簇表達(dá)相對(duì)值的平均值為8.36±1.36，其鄰近正常骨組織miR-17-92基因簇表達(dá)相對(duì)值的平均值為6.24±1.57，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1），且在63例骨肉瘤組織中有51例miR-17-92基因簇的表達(dá)高于相鄰正常骨組織的表達(dá)，提示miR-17-92基因簇在骨肉瘤組織中表達(dá)可能與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

圖1 miR-17-92基因簇在63例骨肉瘤組織和鄰近正常骨組織中的表達(dá)Figure 1 miR-17-92 cluster expression in 63 pairs of osteosarcoma and adjacent normal bone tissues

2.2 miR-17-92基因簇與骨肉瘤患者臨床病理特征的相關(guān)性

根據(jù)miR-17-92基因簇表達(dá)的平均值［5］，63例骨肉瘤患者分為低表達(dá)組25例，高表達(dá)組38例。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)miR-17-92基因簇的高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)，而與患者的性別、腫瘤部位、年齡、病理類型、腫瘤大小、Enneking分期等因素?zé)o關(guān)（表1）。

2.3 Kaplan-Meier生存分析

25例miR-17-92基因簇低表達(dá)組骨肉瘤患者中有8例死亡，平均生存時(shí)間為8.12個(gè)月，5年生存率為68.0%；38例miR-17-92基因簇高表達(dá)組骨肉瘤患者中有23例死亡，平均生存時(shí)間為7.04個(gè)月，5年生存率為39.5%。從圖2中可以看出，miR-17-92基因簇高表達(dá)組骨肉瘤患者5年生存率及平均生存時(shí)間均低于低表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008，圖2）。

2.4 Cox回歸分析

對(duì)所有臨床病理指標(biāo)進(jìn)行單因素Cox回歸分析，取P＜0.05的因素再進(jìn)行多因素回歸分析：?jiǎn)我蛩胤治鼋Y(jié)果顯示骨肉瘤患者的miR-17-92基因簇高表達(dá)及進(jìn)展對(duì)患者預(yù)后均有影響（P＜0.05），進(jìn)一步行Cox多因素分析結(jié)果顯示miR-17-92基因簇高表達(dá)、進(jìn)展均是影響骨肉瘤患者預(yù)后的獨(dú)立因素（P＜0.05，表2，3）。

表1 63例骨肉瘤患者miR-17-92基因簇的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Table 1 Association between miR-17-92 cluster expression and the clinicopathological parameters in 63 osteosarcoma patients

圖2 骨肉瘤患者miR-17-92基因簇表達(dá)和生存時(shí)間之間的關(guān)系Figure 2 Correlation between miR-17-92 cluster expression and survival rates in 63 osteosarcoma patients

表2 miR-17-92基因簇及一般臨床病理因素在骨肉瘤患者預(yù)后中的單因素分析Table 2 Univariate analysis of the associations of prognosis with various clinicopathological parameters and miR-17-92 cluster expression in osteosarcoma

3 討論

miRNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸非編碼小分子RNA，雖然其只占人體基因數(shù)的2%，卻可以調(diào)控30%以上基因的表達(dá)［6］。miRNA主要是通過(guò)與下游靶基因mRNA 3'-UTR結(jié)合，導(dǎo)致靶基因mRNA降解以及抑制轉(zhuǎn)錄后的翻譯，調(diào)控靶基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用［7］。

表3 miR-17-92及一般臨床病理因素在骨肉瘤患者預(yù)后中的多因素分析Table 3 Multivariate analysis of the associations of prognosis with various clinicopathological parameters and miR-17-92 cluster expression in osteosarcoma

已有文獻(xiàn)報(bào)道［8-12］miRNA在骨肉瘤組織中處于異常狀態(tài)，一部分miRNA被上調(diào)，另一部分miRNA被下調(diào)，這些miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起癌基因或者抑癌基因的作用。近年來(lái)關(guān)于miR-17-92基因簇參與調(diào)控腫瘤生物學(xué)行為的研究已越來(lái)越引起重視，一系列研究表明miR-17-92基因簇作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子廣泛地參與調(diào)控多種腫瘤生物學(xué)行為相關(guān)的基因，同時(shí)亦表明miR-17-92基因簇的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［13-14］，而對(duì)于miR-17-92基因簇在骨肉瘤組織中的表達(dá)情況鮮見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果示miR-17-92基因簇在骨肉瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于鄰近正常骨組織中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)miR-17-92基因簇的高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)，而與患者的性別、腫瘤部位、年齡、病理類型、腫瘤大小、Enneking分期等因素?zé)o關(guān)，這與其在食管癌、髓母細(xì)胞瘤等腫瘤中的研究結(jié)果一致［5，15-16］。進(jìn)一步研究顯示高表達(dá)miR-17-92基因簇的骨肉瘤患者有著更差的預(yù)后，經(jīng)Cox多因素生存分析亦證明miR-17-92基因簇表達(dá)是影響骨肉瘤患者預(yù)后的獨(dú)立因素之一，說(shuō)明miR-17-92基因簇是影響骨肉瘤臨床生物學(xué)行為的重要因素，對(duì)骨肉瘤病情進(jìn)展及預(yù)后有影響，miR-17-92基因簇可能與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，表明miR-17-92基因簇也可以作為骨肉瘤患者的一個(gè)有效預(yù)后指標(biāo)。但是本研究患者腫瘤標(biāo)本例數(shù)有限，隨訪臨床資料的不全等因素，未能更詳盡分析其表達(dá)變化與術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、5年生存率等臨床因素之間的相關(guān)性，同時(shí)miR-17-92基因簇具體是何種編碼的miRNA在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，以及作用于哪些下游靶基因，均是需要進(jìn)一步研究的內(nèi)容。

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（2014-08-01收稿）

（2014-10-27修回）

（本文編輯：楊紅欣）

Expression of miR-17-92 cluster in osteosarcoma and its clinical significance

Jinluan LIN1,Fasheng WANG1,Junjian YE1,Zhaoyang WU1,Xiang LI2,Jianhua LIN1

1Department of Orthopedics,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350005;2Department of Orthopedics,Zhejiang Taizhou No.1 People's Hospital,Taizhou 318000,China

Jianhua LIN;E-mail:jianhual@126.com

Objective:To determine the expression of miR-17-92 cluster in osteosarcoma tissue samples and explore its association with clinical significance.Methods:Quantitative polymerase chain reactiom analysis was used to examine the expression of miR-17-92 cluster in osteosarcoma tissues.Normal bone tissues from 63 patients were matched,and the relationships between the expression of miR-17-92 cluster and the clinicopathological features and prognosis of osteosarcoma were explored.Results:The relative expression of miR-17-92 cluster in osteosarcoma tissues was significantly higher than those in adjacent normal tissues(P＜0.05).The high expression of miR-17-92 had a significant correlation with reduced survival(P=0.027).Conclusion:The expression of miR-17-92 cluster closely correlates with the occurrence and progress of osteosarcoma and may be used as an indicator for osteosarcoma prognosis.

miR-17-92 cluster,osteosarcoma,prognosis

10.3969/j.issn.1000-8179.20141243

①福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科（福州市350005）；②浙江省臺(tái)州市第一人民醫(yī)院骨科

*本文課題受福建省臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目和福建醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科（編號(hào)：XK201106）資助

林建華 jianhual@126.com

This work was supported by the Clinical Key Subject and Construction Project in Fujian Province and the Fujian Medical University Key Clinical Medical Disciplines(No.XK201106)

林金鑾 專業(yè)方向?yàn)楣悄[瘤臨床及基礎(chǔ)研究。

E-mail：jinluanlin@163.com