范小斌 林秋雄 羅燕飛

·基礎研究·

Hsa-miR202通過下調IL-10的表達抑制肺癌A549細胞的增殖

范小斌①林秋雄②羅燕飛①

目的：探討Hsa-miR202（人微小非編碼RNA-202）對肺癌A549細胞增殖的影響及分子機制。方法：將Hsa-miR-202序列與ppG/miR/eGFP/Blasitidin質粒定向連接，構建靶向Hsa-miR-202基因的真核表達載體pmiR-202，運用脂質體將pmiR-202轉染至A549細胞，WST-8法檢測細胞增殖率，RT-PCR檢測IL-10、miR-202的相對表達水平，Western blot與ELISA檢測IL-10蛋白的表達水平，構建熒光素酶報告基因載體驗證miR-202與IL-10的相互結合作用。結果：經DNA測序證實與設計完全一致，測序結果顯示成功構建了miR-202的真核表達載體（pmiR-202），pmiR-202對A549細胞的增殖抑制率（24、48、72 h）分別為12%、38%、52%，并具有時間效應關系，較空白對照組及陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；RT-PCR結果顯示，轉染pmiR-202后，miR-202的表達水平增加；過表達miR-202能下調IL-10基因及蛋白的相對表達水平，其相對水平分別為25%、0.75，IL-10活性的相對表達量為3.26±0.43 pg/mL，較空白對照組及陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）：熒光素酶活性結果顯示，克隆IL-10-3'UTR的質粒與miR-202 mimics共轉染293T細胞，引起熒光素活性的減低。結論：pmiR-202有效抑制A549細胞的增殖，并具有時間-效應關系，其機制可能是miR-202通過靶向結合IL-10的3'UTR從而下調其在A549細胞的表達有關。

Hsa-miR202 IL-10 肺癌 A549細胞 增殖

MicroRNA miRNA是一類長21～25個核苷酸的小分子非編碼RNA，通過與特定mRNA 3'UTR結合抑制蛋白質表達參與生物的發(fā)育代謝及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等生命現(xiàn)象［1］。miRNA在正常肺組織和肺癌組織、小細胞肺癌和非小細胞肺癌（NSCLC）、肺癌和其他實體腫瘤甚至于其他疾病中的表達模式不同。這種不同不但存在于實體腫瘤中，同時也存在于患者的血漿和血清中［2］。miR-202在肺癌細胞呈低表達，具有抑癌的作用［3］，因此運用過表達技術，探討miR-202對肺癌的生物作用，對指導臨床上肺癌的靶向基因治療具有潛在的意義。

白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）是一種具有多向性生物活性的強免疫抑制因子，能通過自分泌或旁分泌的方式促進腫瘤生長，并能抑制細胞程序性死亡，調節(jié)宿主微環(huán)境，影響腫瘤的轉移［4-5］。IL-10是肺癌細胞的自分泌因子，在腫瘤微環(huán)境中產生并釋放至外周血中，具有診斷標志物的應用前景［6-7］。運用生物學軟件（TargetScan 6.2）預測到MiR-202的靶基因IL-10，生物學信息提示兩者之間存在可能相互調控關系，本研究旨在運用構建miR-202真核表達載體質粒，觀察其對肺癌A549細胞增殖作用及分子機制，為進一步揭示肺癌的發(fā)病機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；脂質體LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司）；真核表達載體質粒ppG/miR/eGFP/Blasitidin（上海吉瑪公司）；限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ、T4DNA連接酶（日本TaKaRa公司）；瓊脂糖凝膠回收DNA片段試劑盒、質粒小量提取試劑盒（美國Omega公司）；CCK-8（Cell Count Kit-8）試劑（日本同仁化學研究所）；SYBR green試劑盒、逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；HEK293T、A549細胞株由暨南大學醫(yī)學院生化教研室惠贈；多克隆IL-10抗體、單克隆抗體GAPDH（武漢博士德生物工程有限公司）；ECL試劑盒（碧云天生物技術研究所）Hsa-miR-202（5'-AGAG GUAUAGGGCAUGGGAA3'，MIMAT0002811）miRNA抑制劑（http：//www.mirbase.org/cgi-bin/get_seq.pl？acc=MI zMAT0002811）；陰性對照序列與陰性對照抑制劑購自上海銳博公司。

1.2 方法

1.2.1 Hsa-miR-202真核表達載體的構建 Hsa-mi R-202表達載體模板中的loop結構選用了TTGGCCACTG ACT以避免形成終止信號，microRNA表達載體正義鏈模板的5'端添加了TGCT；反義鏈模板的5'端添加了GTCC。Hsa-miR-202（5'-AGAGGUAUAGGGCAUGGG AA-3'，MIMAT0002811），質粒構建與制備參照文獻［6］，質粒的鑒定測序送上海吉瑪公司完成。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和轉染 A549細胞用含10%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱在培養(yǎng)，每3 d傳代1次。取對數(shù)生長期的A549細胞，嚴格按LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書操作進行。實驗分為3組：空白對照組（不加轉染試劑），pmiR-202組（含有ppG/miR-202/eGFP/Blasitidin質粒、LipofectamineTM2000），陰性對照組（negative group NC，含 LipofectamineTM2000、質粒 ppG/miR/ eGFP/Blasitidin）。

1.2.3 WST-8法檢測細胞增殖抑制率 將1.0×105個/mL A549細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，使pmiR-202終濃度分別為1.6 μg/mL，每組設5個復孔，非特異性對照組終濃度為1.6 μg/mL。置37℃、5% CO2培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育1 h，酶標儀檢測吸光度（A450/655 nm）值并計算各組增殖抑制率。公式：增殖抑制率（%）=（1-ApmiR-202組/A空白對照組）×100%。

1.2.4 構建熒光素酶報告基因載體 運用生物學信息軟件預測miR-202靶基因為IL-10（http：//www.targetscan. org/cgi-bin/targetscan/vert_61/targetscan.cgi?species=Hu man&gid=&miR_c=miR-202-3p&miR_sc=&mir_nc=&mi rg=&sortType=&allTxs=&incl_nc=100）。提取A549細胞基因組DNA作為PCR擴增模板，調取IL-10全長的3'UTR序列，擴展引物分別添加XhoI和NotI酶切位點，XhoI和NotI雙酶切PCR擴增產物，隨后將擴增片段連接至psiCHECK-2載體上。連接產物轉化感受態(tài)DH5a大腸桿菌，酶切鑒定正確的陽性克隆送測序。將構建好psiCHECK-2-IL-10-3'UTR與psiCHECK-2-IL-10-3'U TR-mut質粒按照以下分組進行轉染：1）contrtol；2）miR-202 mimics（50 nmol/L）；3）negative control or NC group，50 nmol/L；4）NI group，100 nmol/L，miRNA inhibitor；5）NCI group，50 nmol/L，a negative control for N）。RNA-Lipofectamine 2000復合物的配制嚴格按LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書操作進行共轉染HEK293T，最后雙熒光檢測。

1.2.5 RT-PCR檢測IL-10的表達水平 細胞分組同1.4，用Trizol法提取RNA，Premir-202轉染A549細胞，于轉染后的48 h分別于熒光顯微鏡下觀察細胞中GFP的表達；進而采取TRizol試劑提取RNA。采用M-MLV逆轉錄酶逆轉錄為cDNA。作為PCR反應的模版。miR-202 RT：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCA ATTCAGTTGAGTTCCCAT-3'）；miR-202F：5'-ACACTC CAGCTGGGAGAGGTATAGGGCATGG-3'；miR-202R：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'）；擴增片段大小72 bp。GAPDH-F：5'GGATTTGGTCGTATTGGG-3'；GAPD H-R：5'GGAAGATGGTGATGGGATT-3'；U6-F：5'-CT CGCTTCGGCAGCACA-3'；U6-R：5'-AACGCTTCACGA ATTTGCGT-3'；擴增片段大小94 bp。采用SYBRgreen摻入法進行熒光定量PCR反應，95℃5 min預變性，95℃15 s，60℃15 s，72℃32 s，共40個循環(huán)，所有的樣本檢測均包含一個不加模板的陰性對照，以排除假陽性的結果。計算運用2-△△Ct值來比較對照組和實驗組的目的基因mRNA相對表達量的差異。

1.2.6 Western blot檢測細胞IL-10的相對表達水平細胞分組同轉染同本文1.2.5，培養(yǎng)48 h，消化收集各組細胞。按細胞裂解液（RIPA）說明書提取細胞蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，根據(jù)定量結果對各蛋白質樣本進行校正。加入樣品溶解液和樣品，置沸水中煮5 min。不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠電泳（10%聚丙烯酰胺分離膠和5%聚丙烯酰胺濃縮膠），電壓80 V，進入分離膠后改為120 V，40 min。將凝膠上的蛋白條帶轉至硝酸纖維膜（NC）上，半干式轉膜15V，18 min；TBST洗膜5 min，5%牛血清白蛋白封閉緩沖液室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。4℃過夜孵育一抗。TBST洗膜3次，每次5 min。37℃孵育二抗1 h。TBST洗膜3次，每次5 min。加入電化學（electrochemiluminescence，ECL）試劑，顯影。BI-2000型圖像分析軟件分析IL-10和GAPDH的積分光密度，以GAPDH作為內參。

1.2.7 ELISA檢測IL-10蛋白的表達水平 將本文1.2.6中提取的蛋白50 μL加入到抗體包被板條的相應孔中，37℃孵箱孵育90 min。洗板4次；加入生物素化抗體工作液，37℃孵箱孵育60 min。洗板4次，加入酶結合物工作液。37℃孵箱孵育30 min。洗板4次；加入顯色劑，避光37℃孵箱孵育10～15 min；加入終止液，混勻后即刻測量OD450值。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，用完全隨機設計的單因素方差分析（one-way ANOVA）分析組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 重組質粒的測序鑒定結果

重組質粒pmiR-202的測序結果與設計的引物序列完全相符，所含目的基因序列準確無誤，表明成功構建了重組真核表達載體（圖1）。

2.2 pmiR-202對A549細胞增殖的影響

采用1.6 μg/mL pmiR-202轉染至A549細胞作用24 h、48 h、72 h后，增殖抑制率分別為12%、38%、52%，具有時間效應關系，較空白對照組及陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結果說明過表達miR-202后，能有效抑制A549細胞的增殖（圖2）。

圖1 重組質粒測序圖Figure 1 Diagrams of recombinant plasmid sequence

圖2 pmiR-202對A549細胞增殖抑制的影響Figure 2 Effects of pmiR-202 on proliferation inhibition of A549 cells

2.3 miR-202與IL-10 3'UTR相互結合作用

運用miRNA靶基因預測軟件TargetScan（human 6.2版本）預測到miR-202 3'UTR序列139 bp和146 bp處有miR-202結合位點。將IL-10 3'UTR全長序列（1 033 bp）克隆到pisCHI-2載體上luciferase基因的下游，構建psiCHECK-2-IL-10N-3'UTR載體，同miR-202 mimics共轉染細胞。進一步分別檢測突變結合位點1（505 bp）、結合位點2（869 bp）和同時突變兩個結合位點（505、869 bp）確證 miR-202與IL-103'UTR的直接結合作用。共轉染miR-202 mimics和psiCHECK-2-IL-10-3'UTR可以顯著減少luciferase的活性（P＜0.05），而突變結合位點1、2或同時突變兩個結合位點，lusiferase的活性幾乎不受影響，證明miR-202通過直接結合到IL-10 3'UTR上而發(fā)揮調控作用（圖3）。

圖3 熒光素酶活性的比較Figure 3 Comparison of luciferase activity

2.4 pmiR-202對miR-202、IL-10相對表達水平的影響

運用1.6 μg/mL的pmiR-202轉染至A549細胞作用48 h后，RT-PCR分別檢測miR-202、IL-10相對表達水平，過表達miR-202后，A549細胞內miR-202表達水平明顯增加，其相對表達水平為145%，較空白對照組與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結果說明構建的pmiR-202質粒有效，實現(xiàn)了miR-202在A549細胞內的過表達。過表達miR-202后，在A549細胞內IL-10相對表達水平顯著下調，其相對表達水平為35%，較空白對照組與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），結果說明miR-202通過直接結合到IL-10-3'UTR下調靶基因IL-10的表達水平（圖4）。

圖4 pmiR-202對miR-202、IL-10相對表達水平的影響Figure 4 Effects of pmiR-202 on the relative expression levels of miR-202 and IL-10

2.5 pmiR-202對IL-10蛋白相對表達水平的影響

用1.6 μg/mL的pmiR-202轉染至A549細胞作用48 h后，運用Western blot檢測IL-10蛋白的相對表達水平。過表達miR-202后，在A549細胞內IL-10蛋白相對表達水平顯著降低，其相對表達水平為0.75，較空白對照組與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖5）。運用ELASA方法檢測IL-10的相對活性，pmiR-202組IL-10的相對表達量為3.26±0.43 pg/mL，明顯低于空白對照組（18.79±0.36 pg/mL）與陰性對照組（17.2±1.2 pg/mL）。結果說明miR-202通過直接結合到IL-10-3'UTR下調靶基因IL-10的蛋白表達水平。

圖5 pmiR-202對IL-10蛋白相對表達水平的影響Figure 5 Effects of pmiR-202 on the relative protein expression levels of IL-10

3 討論

早發(fā)現(xiàn)、早診斷仍是肺癌治療的關鍵［8-9］。miRNA的表達具有時空特異性，在不同組織不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著性差異。這種miRNAs表達模式具有分化的位相性和時序性，miRNA的表達譜不僅指miRNA的種類，也指各種miRNA的豐度，直接反映了細胞組織的分化發(fā)育狀態(tài)。miRNA在不同腫瘤中具有特定的表達模式，這為腫瘤的基因診斷提供了一種新方法［10］。

研究表明Hsa-miR-202在腫瘤的形成中具有促癌與抑癌的作用。石棉作業(yè)的肺癌患者的肺癌組織miR-202呈低表達，可能抑制肺癌的發(fā)生與發(fā)展［11］。Yu等［12］利用RT-PCR分析112例非小細胞肺癌患者組織miR-202/let-7、miR-137miR-182和miR-372的表達情況，發(fā)現(xiàn)可以利用這些microRNA的綜合表達情況來對患者進行診斷。因此，本研究選取在肺癌中具有抑癌作用的Hsa-miR-202，構建其真核表達載體質粒，運用質脂體2000轉染至A549細胞，實現(xiàn)其在細胞中的穩(wěn)定表達，充分發(fā)揮其抑癌作用。DNA測序證實與設計完全一致，測序結果顯示成功構建了miR-202的真核表達載體（pmiR-202），pmiR-202對A549細胞的增殖抑制率（24、48、72 h）分別為12%、38%、52%，具有時間效應關系。

支氣管肺癌的組織勻漿中IL-10水平升高，免疫組化證實IL-10源于腫瘤細胞。肺癌患者的TNM分期越晚，CD4+CD25+T和IL-10的表達水平越高［13］。CD4+CD25+T和IL-10水平隨著腫瘤浸潤轉移程度的增加而升高，從而進一步改變宿主對腫瘤細胞的反應，使腫瘤細胞逃避機體的免疫殺傷［4，7］。本研究而轉染pmiR-202后，能下調IL-10的相對表達水平空白對照組miR-202呈高達，研究結果證實了以上報道。miR-202調控NMYC的表達，并且能夠抑制高擴增NYMC神經母細胞瘤的增殖［14-15］。為了進一步探討miR-202與IL-10相互調控關系，運用生物學信息軟件（Target Scan 6.2）預測到MiR-202的靶基因為IL-10，將克隆IL-10-3'UTR的質粒與miR-202 mimics共轉染293T細胞，引起熒光素活性的減低。結果表明miR-202與IL-10存在相互調控關系。同時，miR-202通過直接結合到IL-10-3'UTR下調靶基因IL-10基因與蛋白的表達水平。

綜上所述，pmiR-202有效抑制A549細胞的增殖，并具有時間-效應關系，其機制可能是miR-202通過靶向結合IL-10的3'UTR，從而下調其在A549細胞的表達。但是本研究僅運用了一株細胞株作為研究對象，存在一定的缺陷，今后將研究miR-202用動物實體瘤的生物學作用，為更深層次揭示miR-202在肺癌的調控機制奠定基礎。

1 Nymark P,Guled M,Borze I,et al.Integrative analysis of microRNA,mRNA and aCGH data reveals asbestos-and histology-related changes in lung cancer[J].Genes Chromosomes and Cancer, 2011,50(8)：585-597.

2 Mao K,Zhang PH,Zhang LG.Study on the early diagnosis of lung cancer microRNA[J].progress in cancer research and clinic, 2012,24(6)：430-432.[毛 愷,張平暉,張立國.microRNA在肺癌早期診斷中的研究進展[J].腫瘤研究與臨床,2012,24(6)：430-432.]

3 Hristov D,Liu L,Adler JR,et al.Technique for targeting arteriovenous malformations using frameless image-guided robotic radiosurgery[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2011,79(4)：1232-1240.

4 Zhai JF,Du FL,Jin YR,et al.Clinical,detection and significance of [J].in lung cancer patients China regulatory T cells in peripheral blood and 2012 of IL-10,29(6)：325-327.[翟晉芳,杜鳳蘭,繩晉雅,等.肺癌患者外周血調節(jié)性T細胞和IL-10的檢測及其意義[J].中國腫瘤臨床,2012,29(6)：325-327.]

5 Zhang SY,Yu M,Gao J,et al.Journal of applied Cameleon calcium measurement system in the process of A549 cell apoptosis induced by H2O2in[J].China cell biology.2013(10).[張四洋,于 淼,高 建,等.Cameleon測鈣系統(tǒng)在H2O2誘導的A549細胞凋亡過程中的應用[J].中國細胞生物學學報,2013,35(10)：1453-1458.]

6 Ge HB.IL-10 in non small cell lung cancer,the prognosis of[J]. and correlation analysis of clinical pulmonary medicine magazine,a preliminary study on the expression level of MMP-9 the 2011,16 (7)：1068-1070.[葛海波.非小細胞肺癌組織中IL-10,MMP-9的表達水平的初步研究及預后相關性分析[J].臨床肺科雜志,2011, 16(7)：1068-1070.]

7 Wang YF,Lu Q,Zhao JB,et al.The differences of[J].spectrum of modern oncology lncRNA expression in small cell lung cancer(06. 2014).[王亞芳,盧 強,趙晉波,等.小細胞肺癌組織中l(wèi)ncRNA表達譜的差異[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學.2014,22(6)：1231-1235.]

8 He JH,Li YG,Xie XY,et al.Construction of eukaryotic expression vector of hsa-miR-203 and its influence on the proliferation and apoptosis of K562 cells[J].Journal of clinical laboratory science, 2012,30(8)：595-598.[何金花,黎毓光,謝杏儀,等.hsa-miR-203真核表達載體的構建及對K562細胞增殖與凋亡的影響[J].臨床檢驗雜志,2012,30(8)：595-598.]

9 Wang H.Research progress of[J].in the diagnosis and treatment of lung cancer MicroRNA China herald of medicine ISTIC,2011,8 (36).[王 鶴.MicroRNA在肺癌診斷和治療方面的研究進展[J].中國醫(yī)藥導報ISTIC,2011,8(36).]

10 Farazi TA,Hoell JI,Morozov P,et al.MicroRNAs in human cancer [M]//MicroRNA Cancer Regulation.Springer Netherlands,2013：1-20.

11 Nymark P,Mohamed Guled,Ioana Borze Integrative analysis of microRNA,mRNA and aCGHData reveals asbestos-and histology-related changes in lung cancer genes[J].Genes Chromosomes Cancer.2011,50(8)：585-597.

12 Yu SL,Chen HY,Chang GC,et al.MicroRNA signature predicts survival and relapse in lung cancer[J].Cancer Cell, 2008, 13(1)：48-57.

13 Fortis C,Foppoli M,Gianotti L,et al.Increased interleukin-10 serum levels in patients with solid tumours.Cancer Lett,1996;104 (1)：1-5.

14 Buechner J,Tomte E,Haug BH.Tumour-suppressor microRNAs let-7 and mir-101 target the proto-oncogene MYCN and inhibit cell proliferation in MYCN-amplified neuroblastoma[J].Br J Cancer.2011,105(2)：296-303.

15 Hung JJ,Jeng WJ,Hsu WH,et al.Predictors of death,local recurrence,and distant metastasis in completely resected pathological stage-I non-small-cell lung cancer[J].J Thorac Oncol,2012,7(7)：1115-1123.

（2014-05-05收稿）

（2014-10-20修回）

（本文編輯：楊紅欣）

范小斌 專業(yè)方向為腫瘤臨床檢驗。

E-mail：fanxiaobinvip@163.com

Hsa-mir-202 inhibit the proliferation of lung cancer A549 cells by reducing expression of IL-10

Xiaobin FAN1,Qiuxiong LIN2,Yanfei LOU1

1Department of Clinical Laboratory,2Medical Research Centre,Guangdong Provincial Academy of Medical Science and the People's Hospital of Guangdong Province,Guangzhou 510080,China

Objective:To study the effects of the overexpression of hsa-miR-202 on the proliferation and molecular mechanism of lung cancer A549 cells.Methods:A sequence of hsa-miR-202 with ppG/miR/eGFP/Blasitidin pasmid was directionally connected and a eukaryotic expression vector pmiR-202 of the target hsa-miR-202 gene was constructed.pmiR-202 was transtected to A549 cell with Lipofectamine 2000.The WST assay was used to detect the cell proliferation rate,and RT-PCR was used to detect the relative gene expression levels.Western blot analysis was used to detect the IL-10 protein expression levels.The interaction between miR-202 and IL-10 was examined using a luciferase reporter assay.Results:The design from the DNA sequencing results shows that a eukaryotic expression vector of miR-202 was successfully constructed.The proliferation inhibition rates of A549 cells by Pmir-202 were 12%, 38%,and 52%.The differences in the treatment group compared with the blank control and negative control groups were statistically significant.The RT-PCR results showed that the relative expression levels of miR-202 increased after transfection with pmiR-202.Overexpression of miR-202 can downregulate the relative gene and protein expression levels of IL-10,and the relative levels were 25%and 0.75,respectively.Compared with the blank control and the negative control groups,the difference was statistically significant(P＜0.05).The fluorescent activity was reduced when transfection was performed with miR-202 mimics,and IL-10-3'UTR plasmid was cloned.Conclusion:pmiR-202 effectively inhibited the proliferation of A549 cells and exhibited a time-effect relationship with miR-202 by targeted combination with IL-10 3'UTR to downregulate IL-10 expression inA549 cells.

hsa-mir-202,IL-10,lung cancer,A549 cells,proliferation

10.3969/j.issn.1000-8179.20140643