鄧小燕 李飛龍 胡 寧 潘嘉川 汪長東

IFT80蛋白對腫瘤影響的研究*

鄧小燕①李飛龍①胡 寧②潘嘉川③汪長東①

目的：探討IFT80（intraflagellar transport 80）蛋白在骨癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、小腸癌、前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌組織的表達分布情況與癌細胞增殖中的作用。方法：免疫組織化學研究IFT80的表達，免疫熒光和細胞培養(yǎng)研究抑制IFT80后對癌細胞增殖的影響和纖毛之間的關系。結果：1）IFT80在胃癌和肺癌組織中高表達，乳腺癌和小腸癌組織中中等表達，骨癌和卵巢癌組織中少量表達，前列腺癌和胰腺癌組織中幾乎不表達；2）抑制IFT80后發(fā)現肺癌細胞增殖加快，纖毛減少變短；3）高分化，ⅡA期胃癌和正常胃組織中IFT80蛋白大量表達，而在低分化晚期，幾乎不表達，在其他不同分化的胃癌中不同程度表達。結論：在不同癌組織中IFT80分布情況不一致。IFT80分布在細胞纖毛上，通過其表達的減少來調節(jié)纖毛的數量和長短參與癌細胞的增殖，故在嚴重癌組織中含量最低。

細胞原纖毛 IFT80 腫瘤 肺癌 胃癌

原纖毛存在于體內幾乎所有類型的細胞，并突出細胞表面，是結構基礎為微管的“毛發(fā)狀”細胞器。在機體發(fā)育、細胞分化和增殖中原纖毛起著必不可少的作用，并參與液體運輸和細胞運動，是各種信號通路的感覺中心，調控各種信號通路，其中比較典型的有Hedgehog信號通路和Wnt信號通路。纖毛形成的關鍵蛋白為IFT蛋白，有20種以上的IFT蛋白，分為IFT-A和IFT-B復合體［1］，IFT蛋白的突變可以導致各種纖毛疾?。╟iliopathies）。研究發(fā)現人體內IFT80基因的突變可引起胸廓發(fā)育不良綜合征（JATD）和短肋-多指Ⅲ型綜合征（SRPIII）［2］，條件性基因敲除IFT80蛋白的動物實驗發(fā)現類似JATD和SRPIII疾病的畸形的發(fā)生和缺陷的Hedgehog信號［3］，另外也有研究發(fā)現IFT80影響了光感受器的發(fā)育［4］。纖毛是各種類型的癌癥發(fā)生發(fā)展的重要決定因素，在分子水平上，Hedgehog信號通路在各種類型的癌癥中發(fā)現有異常的激活，IFT蛋白的缺陷可以引起Hedgehog信號的異常，可見IFT蛋白與癌癥相關。但IFT80與腫瘤之間的研究尚少，彼此之間的聯系尚不明確。本課題研究8種人腫瘤組織和胃癌組織，通過免疫組織化學，檢測IFT80的表達，另外通過觀察沉默IFT80表達后肺癌細胞的變化來探究IFT80與腫瘤之間的關聯。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

8種診斷明確的人腫瘤組織，分別為骨癌（左股骨中上段轉移性腺癌）、肺癌（右上肺中高分化鱗癌）、胰腺腺癌（中分化，并部分胰腺壞死）、胃癌（胃低分化腺癌，侵及全層）、小腸癌（小腸低分化腺癌，侵及外膜）、前列腺癌（Gleason積分6分）、乳腺癌（左乳腺癌）、卵巢癌（左卵巢，漿液性乳頭狀囊腺癌）。以上腫瘤切片均經重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科確診。IFT80抗體購于英國Abcam公司，DAB購自江蘇碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學分析 8種腫瘤切片、不同分期的胃癌組織切片經二甲苯，系列濃度梯度乙醇脫蠟，3%H2O2常溫孵育10 min，去除內源性的過氧化氫酶。胰酶37℃抗原復蘇40 min，5%羊血清蛋白常溫封閉1 h。IFT80蛋白抗體1：100（購自英國Abcam公司）4℃孵育16 h，對照組用PBS代替IFT80蛋白抗體，其余步驟相同。兔抗羊二抗（購自上海生工公司）1：200常溫孵育1 h，DAB（購自江蘇碧云天公司）顯色，蘇木素復染，自來水沖洗，樹膠封片。光學顯微鏡觀察照相（購自日本Olympus公司）。

1.2.2 A549肺癌細胞培養(yǎng)及分組 A549肺癌細胞株購自上海細胞所細胞庫，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。所有實驗均在細胞處于指數生長期進行。實驗分為2組：control組和silence IFT80組，其中silence IFT80小干擾片段由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。它們是Negative control：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，AC GUGACACGUUCGGAGAATT。1#IFT80：CAGCAAGAG UAUAGGUUUATT，UAAACCUAUACUCUUGCUGTT。2#IFT80：GGUGAAGACUGUAAAUAUAUATT，UAU AUUUACAGUCUUCACCTT。3#IFT80：GAGCAAACCA UGUGG GCUUTT，AAGCCCACAUGGUUUGCUCTT。經Real-time PCR實驗發(fā)現，3#IFT80干擾片段抑制IFT80的抑制率達到90%，所以，后續(xù)實驗均選擇3#IFT80小干擾RNA片段。

1.2.3 A549肺癌細胞MTT值測定 96孔板待檢測孔吸出培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)基100 μL，同時加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，振蕩10 min。在570 nm波長處，讀取OD值。設置只加培養(yǎng)液的空白孔，用于調零。對照組為未加任何處理的A549肺癌細胞，測定培養(yǎng)的A549肺癌細胞1～6天的細胞增長情況，繪制細胞生長曲線。

1.2.4 A549肺癌細胞原纖毛免疫熒光檢測 A549肺癌細胞玻片，經二甲苯，系列濃度梯度乙醇脫蠟，3%H2O2常溫孵育10 min，去除內源性的過氧化氫酶。胰酶37℃抗原復蘇1 h，5%白蛋白常溫封閉1 h。一抗4℃孵育16 h，PBS清洗后加入免疫熒光抗體標記，37℃孵育1 h后DAPI染色后PBS清洗后用甘油封片。激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，用Acetylated tubulin抗體（Ac-tub）（購自美國Sigma公司，T6793）標記細胞纖毛鞭毛，IFT80抗體標記IFT80蛋白，DAPI（購自Invitrogen公司）細胞核染色。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數據均采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行χ2分析和t檢驗。全部結果用±s表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 8種腫瘤組織中IFT80的表達

IFT80蛋白在胃癌組織（圖1A）和肺癌組織（圖1B）中高表達，細胞膜和細胞質均深度染色。中表達量的IFT80蛋白的腫瘤組織分別為乳腺癌（圖1C）和腸癌（圖1D）。少量表達IFT80的蛋白腫瘤組織是骨癌組織（圖1E）和卵巢癌（圖1F）。幾乎不表達IFT80的蛋白的腫瘤組織是前列腺癌組織（圖1G）和胰腺癌組織（圖1H）。在人體8種腫瘤組織中，胃癌和肺癌中IFT80含量較多。

2.2 抑制IFT80對A549肺癌細胞的影響

為了研究IFT80基因影響肺癌細胞的增殖，選擇肺癌細胞系A549細胞系作為研究對象，利用RNA干擾技術。沉默IFT80基因肺癌細胞和對照組肺癌細胞在（20倍）顯微鏡下表現，沉默IFT80基因A549肺癌細胞多為圓形，密度較大，常簇狀分布（圖2C），對照組為圖2A。40倍顯微鏡下觀察發(fā)現A549肺癌細胞呈球形或三角形，球形細胞與對照組相比在細胞中比例多（圖2D），對照組為圖2B。MTT法檢測OD值，細胞生長曲線結果顯示在細胞培養(yǎng)的1～6天組與control組相比，增殖的A549細胞多（圖2E）。本實驗結果提示了抑制IFT80表達可能誘導肺癌細胞增殖。

2.3 抑制IFT80對肺癌細胞纖毛的影響

為了觀察沉默IFT80基因后，是否影響細胞原纖毛的數量和長度變化。在激光共聚焦顯微鏡下觀察，發(fā)現在肺癌細胞系A549有細胞原纖毛（圖3 control，Ac-tub；箭頭所示纖毛頂端Acetylated tubulin）和IFT80蛋白（圖3 control，IFT80；箭頭所示IFT80蛋白）存在，IFT80蛋白表達在纖毛上。與control組相比，silence IFT80組IFT80蛋白表達減少，纖毛長度變短或者消失。本實驗表明IFT80存在于細胞纖毛上，抑制IFT80可以造成細胞纖毛的減少或變短。

2.4 IFT80在不同胃癌分期的表達

由于前期實驗發(fā)現胃癌組織大量表達IFT80，為了更深入的研究IFT80在胃癌不同分期的表達情況，本研究購買西安美艾生物科技有限公司的胃癌組織芯片（含正常胃組織，附TNM，臨床分期和病理分期），利用免疫組織化學方法和特異性的IFT80抗體檢測不同病理分期的胃癌組織。顯微鏡下觀察胃癌組織，發(fā)現在高分化，ⅡA期胃癌組織和正常胃組織中IFT80蛋白大量表達（圖4A，4L），而在低分化的胃癌組織晚期，IFT80蛋白幾乎不表達（圖4J，4K），而在其他不同分化的胃癌組織中IFT80蛋白不同程度表達。

?A.Stomach cancer;B.Lung cancer;C.Breast cancer;D.Intestinal cancer;E.Bone tumor;F.Ovarian cancer;G.Prostate cancer;H.Pancreatic cancer圖1 免疫組織化學染色IFT80在8種腫瘤組織中的表達（×10）Figure 1 Immunohistochemical staining for IFT80 expression in eight kinds of tumor tissues（IHC×10）

圖2 沉默IFT80基因增強A549肺癌細胞增殖Figure 2 Silenced IFT80 gene increases A549 lung cancer cell proliferation

?The arrow at the left picture marks acetylated tubulin,and the arrow at the middle picture marks the IFT80 protein圖3 免疫熒光染色cilia在control組和silence IFT80組A549肺癌細胞中的表達（×40）Figure 3 Immunofluorescence staining for cilia expression in A549 lung cancer cells of the control and the silenced IFT80 groups（×40）

圖4 免疫組織化學染色IFT80在不同胃癌分期中的表達（IHC×10）Figure 4 Immunohistochemical staining to detect IFT80 expression in various stages of gastric cancer（IHC×10）

3 討論

現有研究發(fā)現IFT80通過調節(jié)Hedgehog信號通路在骨生成過程中起到了重要的作用［2］，并通過調節(jié)Hedgehog和Wnt信號通路影響軟骨的分化［5］，可見其在細胞分化過程起著重要的作用。癌癥的產生源自于細胞的分化異常，本實驗研究了IFT80在8種癌組織中的表達情況，其中IFT80在8種癌組織中表達程度不同，其中在肺癌組織和胃癌組織中表達最多，而在前列腺和胰腺癌組織中幾乎不表達，IFT80與癌癥的產生可能存在著一定相關性。我們前期實驗也檢測了IFT20在此8種癌組織的表達情況。IFT20在卵巢癌中大量表達；在小腸癌、胃癌、乳腺癌中中量表達；在肺癌、胰腺癌、骨癌中低量表達；在前列腺癌中不表達［6］。而在相同的臨床標本中檢測IFT80，胃癌和肺癌組織大量表達IFT80；乳腺癌和腸癌中等量表達IFT80；骨癌和卵巢癌少量表達IFT80；IFT80在前列腺癌和胰腺癌組織中不表達。雖然IFT80和IFT20同屬于細胞原纖毛的復合體B成分，同行使著逆向轉運細胞信號物質的功能，但在相同的癌組織中表達情況不同，可能在調控腫瘤的生成過程中執(zhí)行的功能具有差異，這需要更深一步的研究來證實此類假設。但實驗結果顯示，前列腺癌組織中均未檢測到IFT80和IFT20蛋白的表達，可以推論前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程與細胞原纖毛和IFT80和IFT20蛋白無明顯的相關性。

IFT80作為IFT蛋白的一種，而IFT蛋白是纖毛形成的關鍵蛋白，其IFT復合物起著裝配和維持纖毛的作用［7］。本實驗證實了IFT80蛋白存在于細胞纖毛上，并且IFT80隨著纖毛在人類腫瘤組織中表達程度的不同而存在變化，實驗發(fā)現在人類腫瘤組織中IFT80多表達在肺癌組織和胃癌組織中，在前列腺和胰腺癌組織中不表達，可見在肺癌組織和胃癌組織中纖毛的數量多而前列腺癌和胰腺癌組織中無表達，這與Shpak等［8］的研究結果相印證為纖毛在癌癥器官組織中的數量多少可能與器官的功能有關，由于纖毛具有機械傳感，信號傳導等作用，故相比于前列腺和胰腺等，機械運動能力較強的肺與胃中纖毛存在多，所以在其癌組織中可以觀察到較多的纖毛和IFT80蛋白。

IFT復合體沿軸絲微管進行雙向物質運輸，包括基底到纖毛頂端的正向運輸和頂端到基底的逆向運輸，IFT80蛋白同樣參與了纖毛軸絲中蛋白的運輸。本實驗細胞免疫熒光研究發(fā)現IFT80蛋白分布和纖毛的分布重疊，多分布于纖毛軸絲上，通過抑制IFT80可以導致肺癌細胞纖毛的減少或變短，在顯微鏡（40倍）下觀察可見三角形細胞數量的減少同樣證明了抑制IFT80可以減少或變短纖毛，提示了IFT80的分布在纖毛上，而IFT80參與了細胞上纖毛的數量與長度的調節(jié)，但其詳細機制還需要深入的研究。

本研究首次發(fā)現抑制IFT80可促進肺癌細胞的增殖，而低分化的晚期胃癌組織中IFT80蛋白的含量減少，這都提示了IFT80與癌細胞的增殖相關。在癌細胞的增殖過程中，IFT80的作用機制可能與癌細胞纖毛的減少或變短有關。纖毛的減少或者變短如何促進癌變細胞的增殖，可能在于多方面：1）中心粒的異常 增多 ：Polycystin-1（Pkd-1）和 Polycystin-2（Pkd-2）是位于纖毛膜上的蛋白，Pkd-1和Pkd-2的缺乏可以導致中心粒的增殖［9］，而異常增殖的中心?？梢源龠M著絲粒、中心體和非整倍體的異常，促進癌癥的發(fā)生［10］。2）中心體缺陷：IFT80的缺失可能照成類似IFT20缺失引起的中心體缺陷，從而導致中心體移位，進一步引起有絲分裂過程中紡錘體的方向性異常而使細胞不能有序分裂，而引起細胞分化失常［11］。3）異常的Hedgehog信號：Shh是Patched（Ptc）可溶性配體，Ptc坐落在纖毛上，纖毛的減少不會影響到Shh配體，而在缺乏Shh時Ptc抑制了的Smoothened（Smo）的活性，當纖毛減少和短小時通過Shh刺激Ptc離開纖毛，從而解除對于Smo的抑制，相反的Smo進入了纖毛刺激Gli家族［12-13］，Gli家族蛋白，如Gli2，進入細胞核內上調相應的基因表達，從而加快細胞周期進程，促進細胞增殖［14～15］。在不同分化程度的胃癌組織中，本實驗發(fā)現在高分化，ⅡA期胃癌組織和正常胃組織中IFT80蛋白大量表達，而在低分化的胃癌組織晚期，IFT80蛋白幾乎不表達，并且在其他惡化程度的胃癌組織中IFT80蛋白表達有一個可見的梯度的變化，總的來說惡化程度越重，IFT80表達越少，可見IFT80可以做為一種新的診斷胃癌分期的檢測指標，為在臨床上制定胃癌的治療方案提供一種新的參考。

本研究結果顯示了在癌癥組織中有IFT80蛋白的存在，并且各個器官中IFT80分布情況不一致，其多分布在機械運動功能強的纖毛數量多的器官中，如肺和胃。IFT80分布在細胞纖毛上，IFT80表達的減少可改變纖毛的數量和長短，從而通過多種途徑直接或間接參與癌細胞的增殖，并且在胃癌組織中，IFT80表達的多少與癌癥惡化程度相關。惡化程度越嚴重的胃癌組織中表達最少，而惡性程度低的胃癌組織中表達最多，如低分化的癌癥晚期，其含量最低，幾乎沒有。綜上所述，IFT80在癌癥的增殖方面有著重要的作用，并且其可以做為一種新的診斷胃癌分期的診斷指標，但IFT80引起癌癥的具體機制和如何診斷胃癌分期還需要進一步的研究。

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（2014-07-23收稿）

（2014-09-26修回）

（本文編輯：賈樹明）

The effects of IFT80 proteins on tumors

Xiaoyan DENG1,Feilong LI1,Ning HU2,Jiachuan PAN3,Changdong WANG1

1Department of Biochemistry and Molecular Biology,Functional Genomics Lab,Molecular Medicine and Cancer Research Center,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;2Department of Orthopedics,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;3Department of Biomedical and Chemical Engineering,Syracuse University,Syracuse,New York 13244,United States of America

Chang-dong WANG;E-mail:cdwhust@163.com

Objective:To investigate Intraflagellar Transport 80(IFT80)protein expression in bone,lung,pancreatic,stomach,intestinal,prostate,breast,and ovarian cancers to explore its mechanism in cancer cell proliferation and to diagnose and identify new targets in cancer treatment.Methods:Immunohistochemistry was used to investigate the expression of IFT80 in gastric cancer tissue of different stages and in eight other kinds of human cancer tissues.We studied the relationship between cancer cell proliferation and inhibition of IFT80.Immunofluorescence method and cell culture were used to study the cilia and IFT80.Results:Results showed the following:a)the expression of IFT80 was high in gastric and lung carcinoma tissues,moderate in breast and colorectal cancers,low in bone and ovarian cancers,and nearly absent in prostate and pancreatic cancers;b)inhibition of IFT80 in the A549 cancer cell line accelerated cell proliferation and resulted in shorter,lower quality cilia;and c)IFT80 was abundantly expressed in cancer tissues of well-differentiated stage-IIA gastric cancer and normal gastric tissues,but was hardly expressed in late-stage,poorly differentiated gastric cancer.IFT80 could have various degrees of expression in gastric carcinoma of other stages and differentiation.Conclusions:Different cancer organs showed variation in IFT80 expression.IFT80 can be distributed in the organs with mechanical motion function,such as lungs and stomach.IFT80 is distributed on the cell cilia and can adjust the number and length of the cilia by reducing IFT80 protein expression.Through a variety of ways,IFT80 directly or indirectly participates in the proliferation of cancer cells.Thus,the lowest or nearly zero expression of IFT80 can be seen in cancer tissues of high-grade malignancy,such as advanced cancers with poor differentiation.

primary cilia,IFT80,tumor,lung cancer,gastric carcinoma

10.3969/j.issn.1000-8179.20141229

①重慶醫(yī)科大學生物化學和分子生物學教研室，分子醫(yī)學與腫瘤研究中心（重慶市400016）；②重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科；③美國紐約州雪城大學生物醫(yī)學與化學工程系

*本文課題受教育部博士點基金項目（編號：20125503120015）；重慶市自然科學基金項目（編號：cstc2014jcyjA10024，cstc2011jcyjA10033）和重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院青年基金項目（編號：0800280031）資助

汪長東 cdwhust@163.com

This work was supported by the Doctoral Scientific Fund Project of the Ministry of Education of China(Nos.20125503120015) and the National Science Foundation of Chongqing(Nos.cstc2014jcyjA10024 and cstc2011jcyjA10033)and the Young Foundation of the School of Basic Medicine of Chongqing Medical University(Nos.0800280031)

鄧小燕 專業(yè)方向為腫瘤分子生物學、腫瘤生物信息學。

E-mail：xydeng_cqmu@126.com