梁良+韓曉敏+張爭(zhēng)+郭慶梅+徐艷紅+劉娟+廖永翠

[收稿日期] 2013-10-28

[基金項(xiàng)目] 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31000136， 81173481）；北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（6102024）；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（2008）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（20091106120009）；國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAI01B07）；海南省中藥現(xiàn)代化專項(xiàng)項(xiàng)目（2010ZY001， 2012ZY002）；海南省重大科技研發(fā)專項(xiàng)（ZDZX20100006）

[通信作者] *張爭(zhēng)，Tel：（010）57833363， E-mail：zhangzheng321@126.com；*郭慶梅，教授，博士生導(dǎo)師，Tel：18615187362，E-mail：qmguo@sina.com

[作者簡(jiǎn)介] 梁良，Tel：（010）57833363，E-mail：liangliang0118ll@126.com

[摘要] 對(duì)國(guó)產(chǎn)沉香的基原植物白木香Aquilaria sinensis肉桂酸-4-羥基化酶基因C4H編碼區(qū)進(jìn)行克隆，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和表達(dá)分析。根據(jù)已報(bào)道的白木香傷害轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序結(jié)果分析獲得1條具有肉桂酸羥化酶酶保守結(jié)構(gòu)域的C4H基因序列，采用RT-PCR技術(shù)克隆得到白木香C4H基因編碼區(qū)序列，并對(duì)C4H蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。另外，采用qRT-PCR方法對(duì)C4H基因在傷害脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析。序列分析表明，所克隆的C4H基因編碼區(qū)開(kāi)放閱讀框（opening reading frame，ORF）長(zhǎng)為1 515 bp，編碼514個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)為KF134783。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證明C4H基因受不同傷害處理的誘導(dǎo)，分別在8，20 h達(dá)到最高表達(dá)水平。白木香C4H基因的編碼區(qū)序列的分離克隆為進(jìn)一步研究C4H蛋白在白木香中黃酮及芳香族類化合物合成途徑中的功能及表達(dá)調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] C4H酶； 白木香； 芳香族化合物； 傷害

國(guó)產(chǎn)沉香為瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis（ Lour. ） Gilg 含樹(shù)脂的木材。作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，沉香有具行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘的功效，用于胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急^[1]。沉香只有在健康白木香樹(shù)受到外界傷害后才能形成^[2]。但是，傷害誘導(dǎo)沉香形成的分子機(jī)制一直未得到清晰揭示， 制約了高效結(jié)香技術(shù)的建立。沉香的化學(xué)成分主要為：倍半萜類、芳香族類成分和2-（2-苯乙基）色酮^[3-4]。合成芳香族化合物的苯丙烷途徑的關(guān)鍵酶之一是肉桂酸-4-羥基化酶 [5]。研究表明，C4H在轉(zhuǎn)錄水平上的豐度和蛋白質(zhì)水平上的活性能有效影響植物中芳香族化合物和黃酮類化合物的生物合成量^[6-8]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已知的植物C4H的氨基酸序列進(jìn)行同源序列比對(duì)，設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用RT-PCR從白木香中克隆C4H基因全長(zhǎng)并進(jìn)行序列分析，了解白木香C4H基因的結(jié)構(gòu)與功能，這對(duì)從分子水平上探討白木香苯丙烷類次生代謝途徑具有重要意義。

1 材料

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所溫室栽培的3年生白木香莖誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷分別進(jìn)行機(jī)械傷害（用滅菌后的刀片切割至體積約為5 mm3的小塊）和100 μmol·L^-1MeJA（茉莉酸甲酯）處理，于處理后2，4，8，12，16，20，24 h取樣，用于提取總RNA，檢測(cè)C4H基因在健康和傷害后愈傷組織中的表達(dá)差異。

2 方法

2.1 總RNA提取

按照EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒（Aidlab，中國(guó)）實(shí)驗(yàn)操作步驟進(jìn)行RNA制備，制備好的總RNA最終溶解于30 μL RNase free水中， 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，分光光度計(jì)NanoDrop 2000C （Thermo Scientific， 美國(guó)） 測(cè)定RNA濃度。

2.2 cDNA第一鏈的合成

利用TaKaRa公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit 試劑盒將白木香總RNA反轉(zhuǎn)錄為第一鏈互補(bǔ)鏈DNA （ cDNA）。反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件及程序均按照TaKaRa公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.3 C4H基因的克隆

從白木香轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序^[9]結(jié)果中獲得1個(gè)由表達(dá)序列標(biāo)簽拼接而成的序列，經(jīng)注釋分析發(fā)現(xiàn)此片段是具有完整開(kāi)放閱讀框的C4H基因，其開(kāi)放閱讀框?yàn)? 515 bp，定名為C4H。

根據(jù)GenBank （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中報(bào)道的植物C4H基因同源性較高的核苷酸序列，設(shè)計(jì)保守區(qū)簡(jiǎn)并引物C4H-F：CTTCTTCCCGACACAAAATATCT 和C4H-R：CCCAAAACAGTACATTGGACAG。以白木香總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，按照下列體系進(jìn)行擴(kuò)增：cDNA 3 μL，10×Pfu buffer 5 μL，dNTP （2.5 mmol·L^-1） 4 μL，Taq Plus（2.5 U·μL^-1） 1 μL，10 μmol 引物各1 μL，終體積為50 μL。反應(yīng)程序95 ℃ 5 min；70 ℃ 60 s；48 ℃ 60 s；72 ℃ 2 min；30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸反應(yīng)5 min；4 ℃保存。經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將回收的目的片段回收與pGM-T載體連接，經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP 10中，用藍(lán)白斑篩選重組子，挑選陽(yáng)性克隆的單菌落37 ℃培養(yǎng)12～16 h，經(jīng)菌液驗(yàn)證后選擇擴(kuò)增出與目的片段一致的條帶的克?。?個(gè)）送上海英濰捷基生物技術(shù)公司（北京測(cè)序部）進(jìn)行測(cè)序。endprint