吳曉毅+巢志茂+孫文+王淳

[收稿日期] 2014-01-28

[基金項(xiàng)目] 人力資源和社會(huì)保障部留學(xué)人員科技活動(dòng)項(xiàng)目（人社廳函[2011]508號(hào)）

[通信作者] *巢志茂，研究員，Tel：（010） 64014411-2869，F(xiàn)ax：（010） 64013996，E-mail：chaozhimao@163.com

[作者簡(jiǎn)介] 吳曉毅，博士研究生，E-mail：wuxiaoyi0000@126.com

[摘要] 白芷中的香豆素類成分在硫磺熏蒸后顯著下降，因此需要對(duì)硫磺熏蒸的白芷建立快速定性鑒別，并建立歐前胡素含量定量模型，實(shí)現(xiàn)藥材質(zhì)量控制的目的。該文使用近紅外（NIR）漫反射光譜技術(shù)采集硫磺熏蒸和非硫磺熏蒸的白芷的NIR光譜，以一階導(dǎo)數(shù)和矢量歸一化的方法進(jìn)行預(yù)處理，采用OPUS/INDENT定性分析軟件Ward′s Algorithm法進(jìn)行聚類分析，在8 806.0～3 811.0 cm^-1的聚類分析結(jié)果可以簡(jiǎn)單，快速地鑒別白芷是否被硫磺熏蒸。同時(shí)，以高效液相色譜法測(cè)定的歐前胡素分析值為參照，結(jié)合OPUS/QUANT定量分析軟件偏最小二乘法，建立歐前胡素含量的定量模型。該模型的相關(guān)系數(shù)（R2），內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方差（RMSECV）和預(yù)測(cè)均方差（RMSEP）分別為0.982 8，0.006 8和0.011 8。建立的歐前胡素NIR定量模型可準(zhǔn)確地用于快速測(cè)定白芷中歐前胡素的含量。

[關(guān)鍵詞] 白芷；近紅外光譜；硫磺熏蒸；聚類分析；歐前胡素

中藥白芷，為傘形科植物白芷Angelica dahurica （Fisch. ex Hoffm.） Benth. et Hook. f.或杭白芷A. dahurica （Fisch. ex Hoffm.） Benth. et Hook. f. var. formosana （Boiss.） Shan et Yuan的干燥根。性溫味辛，歸胃、大腸、肺經(jīng)，具有解表散寒、祛風(fēng)止痛、宣通鼻竅、燥濕止帶、消腫排膿的功效，主要用于感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、鼻淵、牙痛、帶下、瘡瘍腫痛等^[1]。白芷的傳統(tǒng)產(chǎn)地加工方法主要采用硫磺熏蒸法，可使藥材快速干燥，并解決藥材顏色發(fā)黃和生蟲等問題^[2]。但近年來的研究表明，白芷硫磺熏蒸后，其中的香豆素類成分及藥效活性均顯著降低^[3-7]。因此，鑒別硫磺熏蒸樣品，并完成白芷的質(zhì)量控制指標(biāo)——?dú)W前胡素的含量測(cè)定對(duì)藥材質(zhì)量控制以及用藥規(guī)范有重要的意義。當(dāng)前鑒別硫磺熏蒸藥材及飲片的常用檢測(cè)方法有二氧化硫殘留量測(cè)定法^[8]、改良古蔡氏法^[9]、碘滴定-氯化鋇反應(yīng)法^[10]等，白芷中歐前胡素的含量常用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定[1，11]。這些鑒別和測(cè)定方法都需要對(duì)樣品進(jìn)行損害性處理。近年來，近紅外光譜（NIR）技術(shù)因具有操作簡(jiǎn)便、分析速度快、對(duì)樣品無損害、無化學(xué)污染和可實(shí)現(xiàn)在線控制的優(yōu)點(diǎn)，得到了迅速的發(fā)展和利用^[12]，在藥物定性和定量分析中受到了廣泛重視和應(yīng)用^[13-15]。本文將近紅外技術(shù)與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合，采用聚類分析法完成了硫磺熏蒸和非硫磺熏蒸白芷的分類；同時(shí)采用偏最小二乘法建立歐前胡素定量分析模型，實(shí)現(xiàn)了白芷中歐前胡素含量的快速、簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確測(cè)定。這些方便簡(jiǎn)捷、不損害樣品的NIR技術(shù)，對(duì)白芷具有快速的質(zhì)量評(píng)價(jià)價(jià)值。

1 材料

BRUKER MPA 型傅里葉變換近紅外光譜儀，配有漫反射附件、樣品旋轉(zhuǎn)器和石英樣品杯、 PbS檢測(cè)器、OPUS/INDENT定性分析軟件、OPUS/QUANT定量分析軟件（德國BRUKER公司）；島津LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）。

歐前胡素對(duì)照品（成都普思生物科技有限公司，批號(hào)101228-01），乙腈、甲醇（色譜純，Merck公司），純水（娃哈哈純凈水），其他所用試劑均為分析純。

2012年10月，從河北安國市15個(gè)自然村的29個(gè)地塊隨機(jī)采挖白芷的根，除去泥土，晾干。每個(gè)地塊選擇大小一致、無病蟲害、無機(jī)械損傷的白芷6根。其中3根趁新鮮直接切片后晾干，即為非硫磺熏蒸的自然陰干的白芷藥材，編號(hào)1NS至29NS；另3根進(jìn)行了48 h的硫磺熏蒸，直到出現(xiàn)"淌淚"為止，即藥材變軟、表皮有少量液體滲出，達(dá)到傳統(tǒng)的硫磺熏蒸產(chǎn)地加工的基本要求，隨后切片，晾干，即為硫磺熏蒸后的白芷藥材，編號(hào)為30S至58S，見表1。1NS和30S，2NS和31S，3NS和32S，……以此類推，均為同一個(gè)地塊的新鮮白芷根的2種不同加工方法獲得的實(shí)驗(yàn)樣本。樣品經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所巢志茂研究員鑒定為傘形科當(dāng)歸屬植物白芷A. dahurica的根。

2 方法

2.1 近紅外光譜采集

取全部58個(gè)樣品，粉碎，過80目篩，40 ℃烘12 h，每批樣品取4 g，混合均勻后放入石英樣品杯中，輕輕振蕩使分布均勻，采用積分球漫反射測(cè)樣，分辨率8 cm^-1，掃描64次，掃描范圍12 500.0～3 500.0 cm^-1，溫度（25±1） ℃；相對(duì)濕度40%。每批樣品重復(fù)采集3張光譜，取其平均光譜用于數(shù)據(jù)處理。58個(gè)樣品的NIR光譜疊加圖見圖1。

圖1 58個(gè)樣品的NIR光譜疊加圖

Fig.1 The overlapped near-infared spectra of 58 samples

2.2 歐前胡素含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Dikma色譜住[Diamonsil（R）-C18， 4.6 mm×250 mm，5 μm]，柱溫35 ℃，流動(dòng)相乙腈-水（0～10 min，10%～20%乙腈；10～18 min，20%～35%乙腈；18～48 min，35%～55%乙腈；48～68 min，55%～75%乙腈；68～75 min，75%～90%乙腈），流速1.0 mL·min^-1，選用210～800 nm的Max Plot色譜圖。endprint

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定歐前胡素4.90 mg，置于20 mL棕色量瓶中，色譜純甲醇溶解，稀釋至刻度搖勻，制備成質(zhì)量濃度為0.245 g·L^-1的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取1 g白芷藥材粉末（過80目篩）于100 mL燒瓶中，加入70%乙醇50 mL，稱重，水浴加熱回流提取2 h，冷卻后補(bǔ)重，過濾，取續(xù)濾液。精密量取5 mL續(xù)濾液，減壓回收溶劑至干，用色譜純甲醇定容至5 mL，過0.22 μm微孔濾膜，供HPLC分析。

2.2.4 樣品的含量測(cè)定與含量分布 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，分別按2.2.1項(xiàng)方法進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見圖2，計(jì)算得到30個(gè)樣品的歐前胡素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.066%～0.257%。其中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.100%～0.199%的樣品達(dá)到樣品總數(shù)的60%^[16]，該含量分布情況有利于準(zhǔn)確建立定量模型。

A.對(duì)照品溶液； B.供試品溶液： 1.歐前胡素。

圖2 對(duì)照品與供試品HPLC圖

Fig.2 HPLC chromatographies of reference standard and sample

2.3 定性鑒別方法

用于定性鑒別的58個(gè)樣品的NIR光譜原始譜圖經(jīng)21點(diǎn)平滑后進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)求導(dǎo)，采用矢量歸一化法進(jìn)行預(yù)處理，在8 806.0～3 811.0 cm^-1的光譜區(qū)段內(nèi)提取樣品的光譜信息。采用OPUS軟件中的標(biāo)準(zhǔn)法，依據(jù)歐式距離公式計(jì)算譜圖與譜圖之間的距離，根據(jù)計(jì)算的距離大小，通過OPUS/INDENT定性分析軟件中的Ward′s Algorithm法進(jìn)行聚類分析。

歐式距離公式為Dij=∑ K（Aik-Ajk）2，其中，Aik和Ajk分別為i光譜和j光譜在波長(zhǎng)點(diǎn)k處的吸光度。

Ward′s Algorithm法是從方差分析的角度出發(fā)，要求分類的結(jié)果是類內(nèi)方差盡量小，類間方差盡量大。

2.4 建立歐前胡素定量模型的方法

采用交叉驗(yàn)證法，對(duì)2.2.4中進(jìn)行含量測(cè)定的30個(gè)樣品按照歐前胡素含量大小排序，均勻選擇22個(gè)樣品作為校正集，剩下的8個(gè)樣品作為驗(yàn)證集。并使校正集的含量范圍大于驗(yàn)證集^[17]，見表2。將校正集和驗(yàn)證集的NIR光譜與HPLC分析值相關(guān)聯(lián)，采用OPUS/QUANT定量分析軟件中的偏最小二乘法建立歐前胡素含量的定量模型。同時(shí)，以校正模型相關(guān)系數(shù)（R2）、內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方差（RMSECV）和預(yù)測(cè)均方差（RMSEP）作為模型性能的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

3 結(jié)果與討論

3.1 硫磺熏蒸白芷與非硫磺熏蒸白芷的定性鑒別

3.1.1 光譜預(yù)處理及波長(zhǎng)范圍選擇 為消除對(duì)光譜的各種干擾因素，如高頻隨機(jī)噪音、基線漂移、信號(hào)本底、樣品不均勻與光散射等，對(duì)光譜采用一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化法進(jìn)項(xiàng)預(yù)處理。NIR光譜的主要吸收區(qū)域?yàn)楹瑲涞母骷?jí)倍頻和合頻帶。12 500.0～9 000.0 cm^-1為二級(jí)倍頻區(qū)，此區(qū)域譜線漂移嚴(yán)重，強(qiáng)度較弱，為末端效應(yīng)，系統(tǒng)誤差也會(huì)使光譜曲線在末端產(chǎn)生較大噪音，一般不作分析區(qū)域^[18]。從白芷的近紅外光譜可以看出，12 500.0～8 806.0 cm^-1區(qū)段平滑，圖譜信息量較少。8 806.0～5 000.0 cm^-1區(qū)段具有比較豐富的信息，而5 000.0～3 811.0 cm^-1區(qū)段的信息尤為豐富。為了獲得比較全面的圖譜信息，避免高頻隨機(jī)噪音、基線漂移、信號(hào)本底、樣品不均勻與光散射等對(duì)光譜的各種干擾，選取8 806.0～3 811.0 cm^-1的光譜區(qū)段作為近紅外光譜分析的波數(shù)范圍，分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3.1.2 聚類分析 分別將原始光譜圖按照無任何預(yù)處理、21點(diǎn)平滑后進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)求導(dǎo)、21點(diǎn)平滑后進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)求導(dǎo)、矢量歸一化法、21點(diǎn)平滑后一階導(dǎo)數(shù)求導(dǎo)+矢量歸一化法、21點(diǎn)平滑后二階導(dǎo)數(shù)求導(dǎo)+矢量歸一化法的方法進(jìn)行預(yù)處理，在8 806.0～3 811.0 cm^-1由Ward′s Algorithm法得到的聚類分析結(jié)果顯示，21點(diǎn)平滑后一階導(dǎo)數(shù)求導(dǎo)+矢量歸一化法和矢量歸一化法均能將硫磺熏蒸和非硫磺熏蒸的白芷明顯聚為2類。但是，在光譜信息更為豐富的6 955.0～3 857.0 cm^-1區(qū)段，單純的矢量歸一化法不能有效地聚為2類，而21點(diǎn)平滑后一階導(dǎo)數(shù)求導(dǎo)+矢量歸一化法則能將硫磺熏蒸和非硫磺熏蒸白芷聚為2類。8 806.0～3 811.0 cm^-1區(qū)段的NIR圖譜經(jīng)21點(diǎn)平滑后一階導(dǎo)數(shù)求導(dǎo)+矢量歸一化法的聚類分析見圖3。硫磺熏蒸和非硫磺熏蒸的白芷可明顯聚為2類，說明采用NIR光譜技術(shù)可以快速、無損地完成硫磺熏蒸白芷和非硫磺熏蒸白芷之間的定性鑒別。曾有文獻(xiàn)報(bào)道^[3-4]，白芷經(jīng)硫磺熏蒸后，香豆素類成分的總含量下降了60%～80%。因此，可以認(rèn)為，NIR聚類分析結(jié)果的不同，根本的原因在于硫磺熏蒸對(duì)其中化學(xué)成分含量的變化，說明NIR的聚類分析結(jié)果與化學(xué)成分的變化結(jié)果具有一致性。

圖3 聚類分析樹狀圖

Fig.3 Dendrogram showing hierachical result

3.2 白芷中歐前胡素定量模型的建立

3.2.1 光譜預(yù)處理 由于樣品的物理性質(zhì)，如樣品顏色、顆粒大小等會(huì)影響NIR光譜基線的漂移和斜率的變化，對(duì)校正模型的建立產(chǎn)生較大的影響，因此對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理是必要的。本實(shí)驗(yàn)以校正模型相關(guān)系數(shù)（R2）、內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方差（RMSECV）和預(yù)測(cè)均方差（RMSEP）作為模型性能的評(píng)價(jià)指標(biāo)。其中，R2越接近1，RMSECV越小說明樣品化學(xué)值與近紅外預(yù)測(cè)值相關(guān)性越好，且校正模型的結(jié)構(gòu)越合理；RMSEP越小說明模型的預(yù)測(cè)和推廣性能越好。本實(shí)驗(yàn)采用不同的預(yù)處理方法進(jìn)行比較，見表3，4。從中確定具有最優(yōu)值的最佳預(yù)處理方法為一階導(dǎo)數(shù)+減去一條直線法，建模波數(shù)為6 102.2～5 446.3 cm^-1。endprint

3.2.2 主成分?jǐn)?shù)的選定 使用偏最小二乘法建立定量模型時(shí)，主成分?jǐn)?shù)對(duì)模型的穩(wěn)定性影響較大。主成分?jǐn)?shù)過少導(dǎo)致建模信息不完全，預(yù)測(cè)精度不夠，主成分?jǐn)?shù)過多則造成模型過擬合。本實(shí)驗(yàn)采用交叉驗(yàn)證法考察不同主成分?jǐn)?shù)對(duì)RMSECV值的影響，見圖4?？梢哉J(rèn)為，本實(shí)驗(yàn)采用的最佳主成分?jǐn)?shù)以10為宜。

圖4 RMSECV值隨主成分的變化圖

Fig.4 The RMSECV value with different factors

3.2.3 校正模型的建立與驗(yàn)證 本實(shí)驗(yàn)采用交叉驗(yàn)證法，校正集22個(gè)樣品的NIR光譜經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)+減去一條直線法處理后，在6 102.2～5 446.3 cm^-1，選擇前10個(gè)主成分建立最優(yōu)校正模型。該校正模型的R2為0.982 8，RMSECV為0.006 8，RMSEP為0.011 8。以預(yù)測(cè)值與化學(xué)值的比值作為預(yù)測(cè)回收率，計(jì)算8個(gè)驗(yàn)證集樣品的平均回收率為100.1%，見表5，圖5。由此可以認(rèn)為，通過模型獲得的預(yù)測(cè)值與所謂的化學(xué)值具有很大程度的等同性。

圖5 NIR預(yù)測(cè)值與HPLC化學(xué)值的相關(guān)圖

Fig.5 Correlation between NIR predicter and HPLC values

4 結(jié)論

根據(jù)近紅外光譜數(shù)據(jù)信息，與化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)相結(jié)合，采用聚類分析法可快速直觀地區(qū)分硫磺熏蒸白芷和非硫磺熏蒸白芷，實(shí)現(xiàn)兩者的定性鑒別。同時(shí)，采用偏最小二乘法建立了白芷中歐前胡素含量的分析方法，根據(jù)驗(yàn)證集的預(yù)測(cè)值結(jié)果與HPLC測(cè)定的化學(xué)值的一致性，表明該定量方法準(zhǔn)確，預(yù)測(cè)精度較高。

白芷硫磺熏蒸后，不僅香豆素類成分的含量降低，而且藥效活性下降，影響其臨床療效。近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)能實(shí)現(xiàn)鑒別白芷是否被硫磺熏蒸的快速鑒別，并能根據(jù)定量模型較為準(zhǔn)確地進(jìn)行歐前胡素的含量測(cè)定。該方法綠色快速無損，方便實(shí)用，將為白芷的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供新的方法和技術(shù)。

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