張 梅，袁 霞，徐 波，冉福香，吳 軍，葛澤梅，李潤濤，崔景榮

（北京大學藥學院1.天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室、2.化學生物學系，北京 100191；3.新疆石河子大學藥學院藥理系，新疆石河子 832000）

PS341（硼替佐米，萬珂）于2003年被美國FDA批準用于多發(fā)性骨髓瘤和淋巴瘤的治療［1］，該蛋白酶體抑制劑通過抑制蛋白酶體中的 CT-L（β5／β5i）、PGPH（β1／β1i）和 T-L（β2i）位點［2］引起細胞周期阻滯和細胞凋亡而產生抗腫瘤作用［3］，但同時也引起神經疾病等不良反應和耐藥性［4］?；赑S341結構的啟發(fā)，李潤濤教授課題組合成了一系列新的三肽硼酸類化合物，經過體內外藥效學篩選發(fā)現(xiàn) YSY01A［N-（2-Pyrazinecarbonyl）-L-leucine-L-（2-naphthyl）-alanine-L-leucine boronic acid］（Fig 1）具有很強的殺傷腫瘤細胞及抗乳腺癌的作用。本文研究了YSY01A對乳腺癌增殖的影響，并以MCF-7細胞株為研究對象，探討了YSY01A的抗癌機制和蛋白酶體靶向作用。

Fig 1 Structure of YSY01A

1 材料與方法

1.1 材料 YSY01A和PS341由北京大學藥學院合成，純度均在99%以上。溶于DMSO中，配制成1×10－2mol·L－1濃度，－20℃凍存。Suc-LLVYAMC、Boc-LRR-AMC、Z-LLE-AMC、Z-RR-AMC和Me4BodipyFL-Ahx3Leu3VS均為 Boston Biochem公司。多克隆抗 體 ubiquitin、NF-κB，IκBα，XIAP、Bax、puma、endonuclease G和單克隆抗體 PARP、BclxL、GAPDH為 CST公司。Phospho-IκBα（P-IκBα）為Santa Cruz公司。野生型p53（wt-p53）為Bioss公司。Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒購自碧云天生物研究所。

1.2 細胞培養(yǎng) 人乳腺癌細胞 MCF-7、Bcap37、MDA-MB-435S細胞株購自中科院上海生命科學院細胞資源中心。MCF-7和MDA-MB-435S用含10%的血清和1%的雙抗 DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，而 Bcap37細胞則用 RPMI 1640培養(yǎng)液。

1．3 26S蛋白酶體提取 收集MCF-7細胞，PBS洗滌2次，用裂解液（50 mmol·L－1Tris-HCl，pH 7.5，1 mmol·L－1DTT，5 mmol·L－1MgCl2，250 mmol·L－1蔗糖，2 mmol·L－1ATP）冰上裂解細胞30 min，低溫（4℃）10 000 r·min－1離心 15 min后，將上清4℃，15 000 r·min－1離心 1 h，去沉淀，用 Bradford法測定蛋白含量。

1．4 26S蛋白酶體的活性檢測 蛋白酶體活性常用熒光底物法檢測。Suc-LLVY-AMC、Boc-LRRAMC、Z-LLE-AMC分別為CT-L、T-L、PGPH的特異性熒光底物。體外活性檢測時，從MCF-7細胞內提取26S蛋白酶體，不同濃度的YSY01A（或PS341）、26S蛋白酶體（12.5μg）和 50μmol·L－1的特異性熒光底物在緩沖液（50 mmol·L－1Tris-HCl，pH 7.5，5 mmol·L－1MgCl2，0.5 mmol·L－1ATP，1 mmol·L－1DTT，0.5 g·L－1BSA）中 37℃孵育 1 h。用多功能酶標儀檢測 （λex＝390 nm，λem ＝440 nm）。檢測體內活性時，用 37.5 nmol·L－1的YSY01A處理細胞1、2、4 h后，提取26S蛋白酶體。按照上述檢測蛋白酶活性的方法檢測熒光強度。

1.5 蛋白酶體活性譜分析 按照文獻［5－6］報道檢測細胞內蛋白酶體活性譜。25 nmol·L－1的YSY01A作用于 MCF-7細胞1、2、4、8、12、24 h。PBS洗滌細胞2次，收集細胞后，按照“1.3”提取細胞內26S蛋白酶體并定量。在競爭試驗中，將26S與Me4BodipyFL-Ahx3Leu3VS（選擇性蛋白酶體熒光探針）（5μmol·L－1）在 37℃共孵育 1 h，蛋白變性后，用質量分數(shù)12.5%SDS-PAGE分離β催化亞基。在凝膠成像儀上觀察膠內帶熒光蛋白條帶。

1.6 蛋白免疫印跡分析 MCF-7細胞接種于培養(yǎng)瓶內，用25 nmol·L－1的YSY01A分別處理細胞6、12、18、24、36 h，用 PBS洗滌細胞2次，收集細胞后，用全蛋白裂解液4℃裂解細胞，12 000 r·min－1離心，取上清，BCA法測定蛋白含量，加入雙蒸水和loading buffer配制成相同濃度的蛋白樣品，100℃煮沸5 min變性。－80℃儲存。等量的蛋白樣品進行質量分數(shù)為10%SDS-PAGE分離，將蛋白轉移到NC膜上，封閉1 h，一抗（ubiquitin、PARP、NF-κB、IκBα、P-IκBα、Bax、Bcl-xL、XIAP、wt-p53、puma、endonuclease G、GAPDH）4℃孵育過夜。TBST漂洗，二抗（1∶10 000）孵育 1 h，TBST漂洗，用 ECL染膜 1 min，暗室中曝光于X膠片上。

1.7 細胞增殖測定 1×104個MCF-7細胞接種于96孔板小孔內，YSY01A和 PS341（12.5、25、50、75、100、200 nmol·L－1）分別處理細胞 48 h。另外接種相同數(shù)量的細胞于96孔板小孔內，用YSY01A（12.5、25、50、75、100、200 nmol·L－1）處理腫瘤細胞（MCF-7或MDA-MB-435S或Bcap37細胞）48 h。采用SRB法檢測細胞存活。

1.8 細胞凋亡檢測 1×106個MCF-7細胞接種于大培養(yǎng)瓶內，用150 nmol·L－1的YSY01A處理細胞8、12、24 h后，PBS洗滌細胞，收集細胞。用 Blocking buffer懸浮細胞，AnnexinV-FITC與細胞室溫共孵育15 min，流式細胞儀檢測前5 min加入PI，然后檢測細胞狀態(tài)。

1．9 線粒體膜電位（MMP）測定 1×106個MCF-7細胞接種于大培養(yǎng)瓶內，用 YSY01A（12.5、25、50、75、100、200 nmol·L－1）處理細胞8 h，用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞，并收集細胞。10 mmol·L－1的JC-1（用無血清培養(yǎng)基作為稀釋液）與細胞在37℃培養(yǎng)箱內孵育30 min，PBS漂洗后，流式細胞儀檢測。1.10 數(shù)據(jù)分析 實驗數(shù)據(jù)用ˉx±s表示，用SAS軟件處理數(shù)據(jù)，方差分析考察統(tǒng)計學意義。

Fig 2 Inhibitory effects of YSY01A on proteasome activity

2 結果

2.1 蛋白酶體抑制作用 細胞外蛋白酶體活性結果（Fig 2A）可看出YSY01A抑制CT-L、T-L和PGPH的活性，且對CT-L活性的抑制作用最強。實驗測得的YSY01A對 CT-L、T-L和 PGPH的 IC50值分別為（138.77±7.28）、（1328.94±146.02）、（716.39±72.31）nmol·L－1，其中 YSY01A抑制 T-L的作用比PS341強4倍，而對另外兩個催化位點的作用，YSY01A弱1～2倍。且YSY01A抑制MCF-7細胞內的蛋白酶體活性（Fig 2B），其抑制特點同細胞外結果一致。通過分析蛋白酶體活性譜（Fig 2C），發(fā)現(xiàn) YSY01A能與 β5／β5i（CT-L活性）、β2／β2i（T-L活性）、β1／β1i（PGPH活性）結合，其結合能力和抑制作用一致。蛋白免疫印跡結果顯示（Fig 2D），YSY01A能使細胞內泛素蛋白表達增加，表明該化合物抑制了蛋白酶體后使得泛素蛋白降解減少，從而出現(xiàn)堆積。這些結果都證實YSY01A是蛋白酶體抑制劑。

2.2 腫瘤細胞增殖抑制作用 雖然YSY01A是PS341同類物，但由于對蛋白酶體催化亞基選擇性不同，所以該化合物的抗腫瘤活性被檢測。12.5～200 nmol·L－1的 YSY01A和PS341均有明顯抑制MCF-7細胞增殖作用（Fig 3A），而且它們抑制細胞的 IC50分別為（42.5±4.5）和（57.1±0.8）nmol·L－1。另外YSY01A也不同程度地抑制另外兩種乳腺癌細胞增殖（Fig 3B），其對 MDA-MB-435S和Bcap37細胞的 IC50分別為（71.5±5.2）、（878.6±18.2）nmol·L－1。由結果可知，MCF-7細胞不僅對YSY01A最敏感，而且在小于100 nmol·L－1時比對PS341敏感性強。

Fig 3 Proliferative inhibitory effects of YSY01A on cancer cells

2.3 誘導細胞凋亡 YSY01A（150 nmol·L－1）作用MCF-7細胞8、12、24 h后，均出現(xiàn)細胞凋亡（Fig 4A）。結果顯示，YSY01A能引起細胞早期和晚期凋亡，細胞凋亡率分別為14.83%±1.30%、18.49%±2.71%、27.59%±1.39%，與對照組比較，差異均有顯著性（P＜0.05）。50 nmol·L－1的 YSY01A作用細胞12 h時（Fig 4B），全長PARP蛋白表達減少，而斷裂的PARP部分增加，表明細胞出現(xiàn)凋亡，且隨時間延長，細胞凋亡明顯增加。

2．4 NF-κB通路 大多數(shù)蛋白酶體抑制劑的抗腫瘤作用都與NF-κB通路有密切關系。YSY01A具有抑制蛋白酶體的活性，考察了YSY01A對NF-κB系統(tǒng)的影響，結果如圖（Fig 4C），50 nmol·L－1的YSY01A作用細胞2～24 h，P-IκBα呈現(xiàn)明顯的時間依賴性增加，而I-κBα則呈現(xiàn)時間依賴性減少，但細胞內NF-κB沒有明顯變化。

Fig 4 Effects of YSY01A on apoptosis and NF-κB pathway

2.5 線粒體膜電位降低 線粒體是細胞凋亡的核心部位，不管是外源性還是內源性的凋亡最終都經線粒體途徑誘導細胞凋亡，因此YSY01A對線粒體膜電位的影響首先被檢測（Fig 5A）。結果顯示，12.5～200 nmol·L－1的 YSY01A能使 MCF-7細胞內JC-1單體增加，表明線粒體膜電位下降；與對照組相比，膜電位下降的細胞數(shù)增加了7.5% ～22.5%，而且呈濃度依賴性。檢測了線粒體相關蛋白的表達（Fig 5B），結果顯示，隨著YSY01A濃度的升高，MCF-7細胞內的Bax蛋白表達增加，Bcl-xL蛋白表達減少，而兩者的比值明顯增大。凋亡抑制分子XIAP表達沒有明顯變化，但wt-p53和其調節(jié)的puma蛋白表達明顯增加。

Fig 5 Effects of YSY01A on mitochondrial pathway

3 討論

蛋白酶體抑制劑已經成為重要的抗腫瘤藥。雖然PS341抗瘤譜廣，抑制腫瘤生長作用強，但因其嚴重的不良反應使得該藥物在腫瘤治療方面受到限制。因此發(fā)現(xiàn)新蛋白酶體抑制劑成為抗腫瘤研究熱點之一。

本研究選用3種乳腺癌細胞，通過考察YSY01A對細胞增殖抑制的作用，發(fā)現(xiàn)該化合物在納摩水平就能明顯抑制MCF-7細胞的增殖。因此本研究以MCF-7細胞為模型，研究了YSY01A的抗癌機制及對蛋白酶體活性的影響。研究結果表明YSY01A能抑制MCF-7細胞中蛋白酶體的3個催化亞基，而且對CT-L的抑制作用最強，其次是PGPH，雖然對T-L的作用較弱，但比PS341作用強4倍。通過蛋白酶體活性譜的研究，發(fā)現(xiàn)YSY01A能與β5、β5i、β1、β1i、β2和 β2i活性位點結合，而 PS341則阻礙 β5、β5i、β1、β1i和 β2i位點［2］。這些結果證明YSY01A對蛋白酶體的選擇性與PS341不同。

蛋白酶體抑制劑的細胞毒性與抑制CT-L、T-L、PGPH活性有密切關系。一般蛋白酶體抑制劑抑制CT-L和T-L或PGPH就具有很強細胞毒作用，但如果3個活性位點都被抑制，使化合物的活性會進一步增加［7］。本實驗結果也證明了這一點，YSY01A抑制MCF-7細胞增殖的作用比PS341的作用強；在MCF-7、Bcap37和 MDA-MB-435S 3種乳腺癌細胞中，YSY01A的抑制MCF-7細胞增殖作用最強。

細胞凋亡是細胞程序化死亡，主要包括外源性（死亡受體通路）和內源性凋亡途徑（線粒體途徑）。本研究證實YSY01A是通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。除了經典的凋亡途徑外，還有其他一些細胞因子會調節(jié)細胞凋亡。Puma是被p53調節(jié)的線粒體膜蛋白，促進細胞色素C釋放［8］。XIAP凋亡抑制蛋白是IAP家族中最強的凋亡抑制因子。當?shù)蛲霭l(fā)生時，線粒體膜孔開放，Cytochrome C、Endonuclearse G和AIF從線粒體中釋放到胞質內，Cytochrome C可以激活下游的Caspases蛋白，導致PARP斷裂，損傷DNA誘導凋亡。Endonuclearse G則轉入細胞核內促發(fā)DNA片段化［9］。本研究結果表明YSY01A能誘導細胞凋亡，通過抑制蛋白酶體活性，導致細胞內的wt-p53增加，并進一步激活線粒體膜上的puma蛋白，同時使Bcl-xL減少，而Bax增加，導致膜電位下降，膜孔開放，釋放 Endonuclearse G，而且PARP被激活，最終引起凋亡。

細胞凋亡是一個非常復雜的過程，也受很多通路的調節(jié)。有研究證實PS341通過NF-κB誘導細胞凋亡，而且和自噬也有關系［10－12］。理論上講，YSY01A抑制蛋白酶體活性，造成P-IκBα的表達增加，應該引起IκBα蛋白表達增加，但卻使其表達下降，這可能跟 IκBα其他調節(jié)途徑有關。然而YSY01A對乳腺癌細胞中NF-κB沒有影響，該結果表明YSY01A可能不從NF-κB蛋白水平調節(jié)凋亡。另外，YSY01A是否激活死亡受體通路，是否引發(fā)自噬也需進一步研究探討。

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