高飛燕，張苗苗，徐興然，吳 靜，張恩齊，付愛玲

（西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400716）

血 －腦屏障（blood-brain barrier，BBB）能夠阻擋幾乎所有的大分子和超過98%的小分子藥物的入腦轉(zhuǎn)運，從而阻礙了中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）疾病的治療［1－2］。隨著 CNS疾病發(fā)病率的不斷增加，腦靶向給藥系統(tǒng)正日益受到重視，尋找克服BBB或促進(jìn)藥物透過BBB并使之在腦內(nèi)能達(dá)到有效濃度，已成為腦部疾病治療的發(fā)展目標(biāo)［3］。目前，基因治療 CNS疾病具有廣闊的研究、應(yīng)用和開發(fā)前景。為了能夠通透BBB，常規(guī)的基因治療手段是通過立體定位手術(shù)將基因載體直接輸送至腦內(nèi)，這種手段存在較大弊端：擴(kuò)散范圍小、藥物維持時間短、表達(dá)效率低，且不利于在人體上應(yīng)用［4－5］。

基因治療的關(guān)鍵在于所使用的載體。基因治療的載體通常包括病毒［6］和非病毒載體，與病毒載體相比，非病毒載體具有明顯優(yōu)勢。多肽作為一種非病毒載體，具有生物可降解性、生物相容性、低毒性、易于合成等優(yōu)點，避免了使用病毒載體等傳統(tǒng)方法的毒性和免疫原性，在治療CNS疾病中展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。目前已有文獻(xiàn)報道利用一些富含精氨酸的多肽［7－9］，如（RXRRBR）2XB和 PPTG，在體內(nèi)成功介導(dǎo)了DNA、反義寡核苷酸或siRNA進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮作用。

我們實驗組前期的研究表明，來源于狂犬病毒糖蛋白的一個新型衍生肽（RVG-derived peptide，RDP），可以攜帶外源蛋白質(zhì)特異性的進(jìn)入中樞神經(jīng)細(xì)胞。我們通過基因工程技術(shù)制備出RDP-β-Gal融合蛋白，小鼠尾靜脈注射該融合蛋白后，各組織切片結(jié)果顯示，該融合蛋白分布于整個腦部，而在外周組織幾乎沒有分布［10］。由此，本研究對RDP作為載體介導(dǎo)DNA進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞的可行性進(jìn)行探究。以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）作為報告基因，用RDP包裹報告基因pEGFP，通過體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗以及體內(nèi)動物實驗來檢測細(xì)胞、小鼠組織切片中報告基因產(chǎn)生的蛋白，探究RDP引導(dǎo)的DNA的靶向性及在體內(nèi)、體外的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 試劑 RDP由上海強(qiáng)耀生物有限公司合成（純度＞99%）。pEGFP-N1質(zhì)粒為本實驗室保存。DMEM培養(yǎng)基、F-12培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Hyclone公司。DNA轉(zhuǎn)染試劑 Poly-Fecter購于北京唯尚立德生物有限公司。胰酶購于北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司，神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所饋贈；中國倉鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary，CHO）購于北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。其它試劑均為分析純。

1.2 實驗動物 SPF級的健康♂昆明種小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。小鼠飼養(yǎng)以3～4只分籠，恒溫恒濕，每天給予充足的水，自由飲食，12 h光照，12 h黑暗。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y和CHO分別采用含10%胎牛血清的DMEM-H／F-12（1∶1）和DMEM-H培養(yǎng)液，在37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1．4 質(zhì)粒p EGFP-N1制備及濃度測定 用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取盒提取質(zhì)粒pEGFP，ddH2O稀釋一定倍數(shù)后，紫外分光光度計分別測定DNA稀釋液在260 nm及280 nm的吸收值。記錄OD值，通過公式dsDNA＝50×（OD260）×稀釋倍數(shù)計算確定DNA濃度和純度，以上濃度單位以mg·L－1表示。

1．5 多肽-DNA復(fù)合物的凝膠電泳阻滯測定 根據(jù)不同的質(zhì)量比在室溫下將pEGFP-N1和RDP混合，靜置30 min，用0.8 mg·L－1瓊脂糖凝膠電泳檢測，探究包裹的最佳比例。DNA以 EB標(biāo)記，電泳緩沖液為1×TAE，在電壓為60 V的條件下電泳25 min，用Bio-Rad凝膠成像儀觀察。

1.6 圓二色譜分析 利用圓二色譜來研究RDP與DNA相互作用后構(gòu)象的變化，并對凝膠電泳檢測出的最佳包裹比例進(jìn)行確認(rèn)。

1.7 體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h，在96孔培養(yǎng)板內(nèi)接種SH-SY5Y和CHO細(xì)胞，當(dāng)孔內(nèi)細(xì)胞生長達(dá)到60%～70%融合時開始轉(zhuǎn)染。用PBS沖洗細(xì)胞2次，每孔中加入0.1 ml無血清、無抗生素的培養(yǎng)基。再取該適量培養(yǎng)基，稀釋實驗組（RDP／pEGFP）、對照組（轉(zhuǎn)染試劑／pEGFP）和空白組（pEGFP）復(fù)合物至pEGFP濃度為0.2 mg·L－1，加入培養(yǎng)孔中，每組設(shè)3個平行孔。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h后，移去介質(zhì)，用PBS沖洗細(xì)胞2次，加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)12～24 h，觀察細(xì)胞瞬時表達(dá)。

1.8 動物體內(nèi)組織檢測 將RDP和pEGFP用ddH2O稀釋后按最佳比例混合，室溫靜置30 min。將小鼠隨機(jī)分為實驗組（12只，每只注射0.6 ml RDP／pDNA包裹物），對照組（12只，每只注射等量生理鹽水），在 d 1、d 3、d 5、d 7頸椎脫臼處死小鼠，取其腦、肝、腎等組織，迅速放置于－70℃冰箱，用OCT樹脂包埋，快速冷凍，用冷凍切片機(jī)切片（厚40 μm），在熒光顯微鏡下（Olympus：IX-70）以藍(lán)色波長范圍的光線激發(fā)，觀察EGFP熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2．1 RDP包裹EGFP-N1質(zhì)粒的凝膠阻滯電泳檢測 Fig 1結(jié)果顯示，不同質(zhì)量比條件下RDP與DNA的結(jié)合程度不同。DNA在加入較少的RDP（即R／E＜2∶1）時，部分 DNA未能被陽離子載體完全包覆而向陽極做定向遷移。隨著RDP的量不斷增大，當(dāng)R／E≥2∶1時，質(zhì)粒與多肽結(jié)合的非常緊密，復(fù)合物未發(fā)生遷移，DNA全部被RDP完全包覆而滯留在點樣孔內(nèi)，達(dá)到了對DNA的阻滯作用。因此可得實驗中第5孔的比例為包裹的最佳比例，即RDP和EGFP-N1混合的最佳比例為2∶1。

Fig 1 Gel retardation assay．

2.2 圓二色譜檢測 圓二色譜儀于室溫下測量RDP以及包裹了DNA后的二級結(jié)構(gòu)。RDP包裹了pEGFP后β-折疊由35.2增至54.4，轉(zhuǎn)角由14.9減至2.3。

Fig 2 CD spectra of RDP with or without the plasmid DNA．

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 質(zhì)粒pEGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞12～48 h后觀察熒光表達(dá)。Fig 3結(jié)果顯示，穿膜肽RDP可以攜帶DNA進(jìn)入SH-SY5Y中，并表達(dá)綠色熒光蛋白，而在CHO中未檢測到熒光。此外，復(fù)合物 RDP／pEGFP轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞后，于不同時間點觀察熒光表達(dá)。結(jié)果顯示（Fig 4），基因轉(zhuǎn)染12 h后，即能夠觀測到蛋白表達(dá)，隨著時間的延長，熒光逐漸增加，表明目的蛋白在細(xì)胞中不斷積累，而空白對照孔（僅加入pEGFP）未檢測到熒光。

Fig 3 Complex of RDP／pDNA is transfected into the SH-SY5Y and CHO cells for examination of specific protein expression（×200）A：CHO；B：SH-SY5Y

2．4 小鼠組織切片檢測EGFP基因在體內(nèi)的表達(dá)

復(fù)合物RDP／pEGFP經(jīng)尾靜脈給予小鼠后，分別在d 1、d 3、d 5、d 7觀察綠色熒光的分布。從組織的熒光強(qiáng)弱來看，腦組織的熒光最強(qiáng)，腎和肝次之。

3 討論

本研究中，瓊脂糖凝膠電泳阻滯實驗是用來探索多肽包裹核酸最佳比例的方法，我們驗證了RDP與DNA的最佳包裹比例是2∶1（W／W）。圓二色譜圖顯示出多肽RDP結(jié)合DNA后構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變，由35.2增至54.4，說明多肽結(jié)構(gòu)呈β-折疊構(gòu)象。由于RDP是pI值為12.3的堿性多肽，與帶負(fù)電荷的DNA可能通過正負(fù)電荷之間的靜電作用而結(jié)合。

Fig 4 Complex of RDP／p DNA is transfected into the SH-SY5Y cell for fluorescence analysis of specific protein expression at different times（×200）

Fig 5 Fluorescence expression detected in mouse tissue sections

在體外實驗中，RDP包裹的DNA能特異地進(jìn)入SH-SY5Y細(xì)胞，且隨著轉(zhuǎn)染時間的增加熒光增強(qiáng)，而與之相同試驗條件下的非神經(jīng)細(xì)胞CHO細(xì)胞沒有熒光顯示。在體內(nèi)實驗中，可觀測到小鼠各組織切片中腦組織切片熒光信號最強(qiáng)，且持續(xù)大約1周時間。這些結(jié)果說明，RDP作為一種新型穿膜肽，能夠引導(dǎo)DNA靶向性進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞，在體內(nèi)、體外均可表達(dá)目的蛋白，且不影響生物大分子的活性。

使用多肽作為基因治療載體具有廣闊的應(yīng)用前景。一些穿膜肽，例如TAT、轉(zhuǎn)運素、多聚Arg等能夠在體外將核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)入培養(yǎng)的細(xì)胞中，然而在體內(nèi)，由于血清等其它因素的影響，絕大多數(shù)多肽不能有效引導(dǎo)核酸進(jìn)入細(xì)胞，需要聯(lián)合其它非病毒載體（納米粒子、脂質(zhì)體）才能實現(xiàn)核酸的體內(nèi)轉(zhuǎn)運。在報道的文獻(xiàn)中，僅有MPG和Pep-1可單獨作為體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的載體，但它們多集中在外周，在腦內(nèi)的濃度較低［11］。本實驗中，我們使用的多肽RDP，能讓復(fù)合物進(jìn)入體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞，高效地表達(dá)外源基因，實現(xiàn)了DNA的入神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)運。

RDP介導(dǎo)核酸入腦的機(jī)制目前尚不明確。已知RVG進(jìn)入細(xì)胞是因為它能夠特異性地和神經(jīng)細(xì)胞的煙堿型乙膽堿受體（nAChR）結(jié)合，從而使得病毒可以進(jìn)入細(xì)胞，有文獻(xiàn)報道RVG29-d9R可通過nAChR的α7亞型受體介導(dǎo)siRNA進(jìn)行胞吞作用轉(zhuǎn)運［12－13］。RDP來源于 RVG，因此推測其特異性受體也為nAChR。然而，RDP引導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞的機(jī)制研究表明，RDP及其融合蛋白可能是通過γ-氨基丁酸（GABA）受體介導(dǎo)的內(nèi)吞通路進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞。已知血腦屏障和神經(jīng)細(xì)胞膜表面存在著特異性的GABA受體，而GABA的A型受體 （GABAA）與nAChR同屬于配體門控的離子通道家族，配體進(jìn)入細(xì)胞均依賴網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。此外，GABA和氯丙嗪（網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用抑制劑）可以抑制細(xì)胞對RDP的特異性攝取，說明來源于RVG的RDP可以與GABA受體相互作用，通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞［14］。

總之，本研究表明RDP可能是一個有效的體內(nèi)外神經(jīng)細(xì)胞的基因表達(dá)載體。作為基因治療的一種合適的靶向神經(jīng)細(xì)胞的載體，RDP在未來的非病毒載體應(yīng)用中可能具有較大的潛力。

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