趙 磊，承歐梅，余麗娟，楊 彬，王 佳，李 蓉，諶貝貝，楊俊卿

（重慶醫(yī)科大學(xué)1.藥理學(xué)教研室、2.附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400016）

缺血性中風(fēng)是僅次于癌癥和心肌梗死的高致死性和致殘性疾病。大量的藥物和非藥物干預(yù)措施研究用于減輕或防治缺血性損傷，然而這些干預(yù)措施對于缺血性腦損傷的臨床療效并不十分理想。因此，缺血性腦損傷機(jī)制及防治措施的研究至今仍顯得十分重要。正常的睡眠是保證機(jī)體正常運(yùn)行的生理因素之一，然而大部分患者中風(fēng)后表現(xiàn)為睡意增強(qiáng)和睡眠－覺醒周期紊亂，研究提示睡眠過度和紊亂可引起疲勞、注意力不集中及記憶減退等類似抑郁的表現(xiàn)，并加重缺血后腦損傷［1］。而一定程度的睡眠剝奪，可改善中風(fēng)后睡眠紊亂［2］。近年來研究顯示，短時(shí)間睡眠剝奪對局灶性腦缺血損傷的影響多為矛盾性結(jié)果，有研究發(fā)現(xiàn)有保護(hù)性作用［3］，也有研究發(fā)現(xiàn)可增強(qiáng)腦損傷［4］；研究表明短時(shí)間睡眠剝奪能促進(jìn)正常大鼠的神經(jīng)發(fā)生［5］，而也有報(bào)道睡眠剝奪可減少正常成年大鼠齒狀回細(xì)胞增殖［6］。造成這些矛盾性研究結(jié)果可能與動(dòng)物模型、睡眠剝奪的方式和時(shí)程不同有關(guān)。目前，少見國內(nèi)外對全腦缺血／再灌注腦損傷后睡眠剝奪干預(yù)作用及機(jī)制的研究報(bào)道。本研究擬對大鼠全腦缺血／再灌注后給予一定程度的睡眠剝奪，觀察其對缺血／再灌注大鼠海馬神經(jīng)元損傷和增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SD大鼠由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室；Morris水迷宮系統(tǒng)，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡免疫組化試劑盒購自羅氏公司；5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxyUridine，BrdU）、小鼠抗BrdU單克隆抗體，均購自Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 ♂SD大鼠42只，質(zhì)量200～250 g，大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組（S）、全腦缺血／再灌注損傷組（GCIR），全腦缺血／再灌注損傷＋睡眠剝奪組（GCIR＋SD），每組14只。

1.3 大鼠全腦缺血／再灌注模型制備 雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉合并低血壓建立全腦缺血／再灌注模型［7］。水合氯醛（0.24 mol·L－1）麻醉，分離左、右頸總動(dòng)脈及右側(cè)頸總靜脈，靜脈插管，輸入肝素化生理鹽水，按照大鼠總血容量0.3體積分?jǐn)?shù)抽取，夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈20 min，然后緩慢回輸血液，縫合。假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈和右側(cè)頸總靜脈。

1．4 睡眠剝奪干預(yù)及Brd U標(biāo)記 睡眠剝奪采用小平臺水環(huán)境法［8］。自制裝置為直徑40 cm的水桶，桶中放置一直徑6 cm圓形平臺，平臺高出水面約1 cm，大鼠睡眠剝奪期間正常飲食。造模前1周大鼠每天站立平臺適應(yīng)5 min。自再灌注后48 h開始睡眠剝奪12 h（8∶00AM～8∶00PM），連續(xù)3 d，給予自然光照環(huán)境。為排除該方法所產(chǎn)生的應(yīng)激、活動(dòng)限制等因素，全腦缺血／再灌注組和假手術(shù)組選用直徑18 cm平臺，大鼠在平臺上可以維持正常的睡眠－覺醒周期。標(biāo)記干細(xì)胞增殖的大鼠于睡眠剝奪d 2～d 3，按50μg·g－1量腹腔注射BrdU（Sigma，10 g·L－1）生理鹽水，每日3次，間隔4 h。

1.5 行為學(xué)測試［9］Morris水迷宮直徑150 cm、高60 cm，內(nèi)含直徑12 cm平臺一個(gè)，置于水面下1 cm。水池四壁標(biāo)記A、B、C、D象限，為實(shí)驗(yàn)時(shí)大鼠入水點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)全程實(shí)時(shí)監(jiān)控，電腦記錄數(shù)據(jù)。訓(xùn)練d 1將大鼠放于平臺適應(yīng)1 min，由任意象限池壁放入水中讓其自由游泳至平臺，90 s內(nèi)未找到平臺者，由試驗(yàn)者將其引導(dǎo)至平臺停留15 s后終止試驗(yàn)。d 2～d 4大鼠直接由4個(gè)象限沿池壁放入水中進(jìn)行訓(xùn)練，尋臺時(shí)間超過90 s按照90 s計(jì)算。d 5時(shí)，撤去平臺，隨機(jī)選定一個(gè)象限將大鼠放入水迷宮中，記錄大鼠尋臺潛伏期和軌跡。

1.6 組織病理學(xué)檢查 再灌注后d 7，麻醉大鼠后進(jìn)行在體灌流固定。分離海馬浸泡于4 g·L－1多聚甲醛中固定48 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，冠狀連續(xù)厚4μm切片，HE染色，顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。每個(gè)樣本分別取3張切片，每張切片取5個(gè)高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1．7 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 上述石蠟切片進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，按試劑盒說明，滴加蛋白酶K（20 mg·L－1）溶液，37℃恒溫消化 60 min，滴加 Triton-X100（0.01%）通透 20 min，滴加 TUNEL（50μl）反應(yīng)液，4℃過夜。復(fù)溫后滴加POD，37℃恒溫孵育60 min。DAB顯色，顯微鏡下觀察海馬陽性凋亡細(xì)胞。每個(gè)樣本分別取3張切片，每張切片取5個(gè)高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1．8 Brd U免疫組化 再灌注后d 14，麻醉大鼠后進(jìn)行在體灌流固定。腦組織石蠟包埋，冠狀連續(xù)切厚4μm切片。枸櫞酸加熱修復(fù)，分別用HCl（1 mol·L－1）、HCl（2 mol·L－1）處理，滴加胰酶（1 g·L－1）處理20 min。山羊血清封閉，滴加BrdU一抗（Sigma）（PBS陰性對照），4℃過夜。加二抗 37℃30 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液37℃30 min，DAB顯色，顯微鏡下觀察海馬增殖陽性細(xì)胞，細(xì)胞核呈深棕黃色的顆粒為增殖陽性細(xì)胞，每個(gè)樣本分別取3張切片，每張切片取5個(gè)高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)用ˉx±s表示，免疫組化應(yīng)用Image-pro plus6.0圖像分析，SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 短時(shí)間睡眠剝奪對全腦缺血／再灌注大鼠學(xué)習(xí)與記憶功能的影響 水迷宮結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比，全腦缺血／再灌注組大鼠平均尋臺潛伏期明顯延長（P＜0.05）。與全腦缺血／再灌注組相比，全腦缺血／再灌注＋睡眠剝奪組的尋臺潛伏期的平均時(shí)間明顯縮短（P＜0.05），見 Fig 1、2。

2．2 大鼠海馬CA1區(qū)組織病理學(xué)形態(tài)變化 假手術(shù)組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞核清晰，結(jié)構(gòu)完整。全腦缺血／再灌注組CA1區(qū)胞核固縮深染、結(jié)構(gòu)排列散亂、數(shù)量減少。與全腦缺血／再灌注組相比，全腦缺血／再灌注＋睡眠剝奪組大鼠海馬神經(jīng)元損傷明顯減輕（P＜0.01），見 Fig 3、4。

Fig 2 Morris typical track of rats

Fig 3 Effect of short-term sleep deprivation on CA1 area pathomorphology of rats 7 days after surgery.HE stain（×200）

Fig 4 Percentage of dead neurons in the CA1 area of hippocampus（ˉx±s，n＝4）

Fig 6 Percentage of positive apoptotic cells in the CA1 area of hippocampus（ˉx±s，n＝4）

Fig 7 Effect of short-term sleep deprivation on the number of BrdU-positive cells in DG area 14 days after surgery（×200）

2．3 大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡變化 假手術(shù)組CA1區(qū)僅有少量的散在的TUNEL陽性細(xì)胞。而全腦缺血／再灌注組和全腦缺血／再灌注＋睡眠剝奪組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量較假手術(shù)組明顯增多（P＜0.01）。與全腦缺血／再灌注模型組相比，全腦缺血／再灌注＋睡眠剝奪組大鼠海馬CA1區(qū)陽性細(xì)胞百分比明顯降低（P＜0.05），見 Fig 5、6。

2.4 大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖改變 BrdU免疫組化結(jié)果顯示，假手術(shù)組海馬齒狀回僅見少量的陽性細(xì)胞。全腦缺血／再灌注組和全腦缺血／再灌注＋睡眠剝奪組的陽性細(xì)胞數(shù)均有明顯增加（P＜0.01）。與全腦缺血／再灌注模型組相比，全腦缺血＋睡眠剝奪組大鼠海馬齒狀回區(qū)BrdU陽性細(xì)胞百分比明顯升高（P＜0.05），見 Fig 7、8。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，全腦缺血／再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶功能明顯下降，海馬神經(jīng)元明顯核固縮、凋亡。短時(shí)間睡眠剝奪能明顯改善缺血／再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙、海馬神經(jīng)元損傷和細(xì)胞凋亡。已有相似研究發(fā)現(xiàn)短時(shí)間剝奪可明顯減輕局灶性缺血大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷［3］。正常情況側(cè)腦室室管膜下區(qū)（SVZ）和海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層區(qū)（SGZ）神經(jīng)發(fā)生并不明顯，腦損傷及腦缺血等刺激可增強(qiáng)這兩個(gè)區(qū)域的神經(jīng)元增殖分化［10］，齒狀回新生神經(jīng)元能替代部分丟失神經(jīng)元［11］，這種替代對于中風(fēng)、腦損傷、癲癇等疾病的恢復(fù)起到一定的代償性保護(hù)作用［12］，我們研究也發(fā)現(xiàn)全腦缺血／再灌注組大鼠齒狀回的BrdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，但是并不能明顯減輕全腦缺血／再灌注導(dǎo)致的海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷，其原因可能是此代償性保護(hù)作用尚不足以對抗全腦缺血／再灌注帶來的損傷。然而，我們也發(fā)現(xiàn)短時(shí)間睡眠剝奪能夠進(jìn)一步明顯增加全腦缺血／再灌注大鼠齒狀回BrdU陽性細(xì)胞數(shù)，同時(shí)全腦缺血／再灌注導(dǎo)致的海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷明顯減輕。我們的研究結(jié)果提示，短時(shí)間睡眠剝奪能通過促進(jìn)全腦缺血／再灌注大鼠齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞的增殖而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。關(guān)于短時(shí)間睡眠剝奪促進(jìn)全腦缺血／再灌注大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的機(jī)制目前并不清楚，可能與大鼠海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的表達(dá)增加［13－14］、海馬細(xì)胞外 5羥色胺 （5-HT）持續(xù)升高［15－16］和大鼠海馬神經(jīng)膠質(zhì)相關(guān)炎癥反應(yīng)減輕［17］等有關(guān)，但是需要進(jìn)一步深入研究。

總之，我們的研究結(jié)果顯示，短時(shí)間睡眠剝奪能明顯促進(jìn)海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖，從而改善全腦缺血／再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙和海馬神經(jīng)元損傷，其具體的機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

Fig 8 Percentage of positive BrdU cells in the DG area of hippocampus（ˉx±s，n＝4）

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