陳 蓉，謝梅林

（1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇蘇州 215006；2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥理系，江蘇蘇州 215123）

心肌纖維化是多種心血管系統(tǒng)疾病終末期的共同病理表現(xiàn)，有效地抑制和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化、心室重塑是目前臨床防止心力衰竭、心律失常及心源性猝死等嚴(yán)重不良事件的主要策略［1］，其形成機(jī)制復(fù)雜，涉及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）及多種細(xì)胞因子，是心血管研究領(lǐng)域的重點(diǎn)、難點(diǎn)課題之一。因此，建立一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、可靠的心肌纖維化動(dòng)物模型對(duì)于心肌纖維化的研究有著重要意義。

目前，實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物心肌纖維化的造模方法有：①自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）心肌纖維化［2］；② 糖尿病大鼠心肌纖維化［3］；③ 結(jié)扎腹主動(dòng)脈或單側(cè)腎動(dòng)脈致心肌纖維化［4］；④冠脈結(jié)扎法等引起心肌梗死心肌纖維化［5］；⑤異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌缺血損傷心肌纖維化［6］；⑥病毒感染致病毒性心肌?。?］。其中，異丙腎上腺素皮下注射誘導(dǎo)的心肌纖維化模型優(yōu)勢(shì)在于方法簡(jiǎn)單，無(wú)創(chuàng)且接近自然病程。大鼠皮下注射異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌纖維化文獻(xiàn)較多，小鼠相關(guān)的文獻(xiàn)較少，且異丙腎上腺素的給藥劑量、給藥間隔報(bào)道不一致［8］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)異丙腎上腺素的給藥劑量、給藥間隔進(jìn)行了摸索，成功建立了小鼠的心肌纖維化模型。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種♂小鼠，22～25 g，由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（蘇）2007-0007；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（蘇）2007-0035。實(shí)驗(yàn)處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 儀器與藥物 倒置顯微鏡XDS-1B型（重慶光學(xué)儀器廠）；722型分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；DS-671電子秤（上海寺岡電子有限公司）；80-2型臺(tái)式低速離心機(jī)（上海醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司）；PK-S22電熱恒溫水浴鍋（上海精宏儀器設(shè)備有限公司）；MR23i高速冷凍離心機(jī)（法國(guó)Jouan公司）；MyCycler TM型 PCR儀（美國(guó) Bio-rad公司）。異丙腎上腺素購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司；Hydro試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司；CollagenⅠ引物購(gòu)自上海生工科技公司。其余試劑為分析純。

1.3 模型制備 將昆明種小鼠隨機(jī)分為心肌纖維化模型組和溶媒對(duì)照組，每組10只。模型組小鼠皮下注射5 mg·kg-1異丙腎上腺素1 d后，以2.5 mg·kg-1維持至30 d。溶媒對(duì)照組同法皮下注射等量的生理鹽水。

1.4 心重指數(shù)（cardiac weight index，CW I）測(cè)定 末次注射異丙腎上腺素（對(duì)照組注射生理鹽水）后次日，2組小鼠稱(chēng)重，頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠心臟，稱(chēng)重，計(jì)算CWI。CWI（mg/g）＝全心重/體重。

1.5 小鼠心肌中羥脯氨酸（hydroxyproline，Hydro）含量測(cè)定 采用消化法檢測(cè)小鼠心肌中Hydro含量，組織中的膠原經(jīng)酶消化產(chǎn)生Hydro，Hydro在氧化劑的作用下所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物，與二甲氨基苯甲醛作用呈現(xiàn)紫紅色，在550 nm測(cè)定Hydro含量，具體操作按照Hydro測(cè)定試劑盒?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定總蛋白含量，具體操作按照總蛋白測(cè)定試劑盒進(jìn)行。Hydro含量計(jì)算公式：

1.6 小鼠心室HE染色和M asson染色 小鼠心臟樣本在10%甲醛溶液中固定、石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE和Masson染色，觀察心肌纖維化的程度和膠原的含量，采用自動(dòng)成像分析系統(tǒng)（Visilog 4.1.5，Noesis），計(jì)算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF）。CVF為膠原的面積占總面積的比值。

1.7 CollagenⅠ mRNA測(cè)定 小鼠左心室勻漿后，用TRIzol提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR。CollagenⅠ的引物：上游 5′-ACGTCCTGGTGAAGTTGGTC-3′，下游 5′-CAGGGAAGCCTCTTTCTCCT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為169 bp，退火溫度為55℃。GAPDH的引物：上游 5′-GTATGACGTGGAGTCTACTG-3′，下游 5′-TACTCCTTGGAGGCCATGTA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為728 bp，退火溫度為56℃。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，結(jié)果經(jīng)凝膠掃描圖像處理系統(tǒng)分析，以CollagenⅠ基因擴(kuò)增帶灰度與同管擴(kuò)增的GAPDH基因擴(kuò)增帶灰度之比表示CollagenⅠmRNA表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，顯著性檢驗(yàn)采用one-way ANOVA。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)CW I和小鼠心肌中Hydro含量的影響 皮下注射異丙腎上腺素后，模型組的CWI和Hydro含量均較溶媒對(duì)照組明顯增加（P＜0.01），見(jiàn)Fig 1和Fig 2。

Fig 1 Com parison of CW I from control group and model group（±s，n＝10）**P＜0.01 vs control group

Fig 2 Comparison of Hydro content in m yocardial tissues from control group and model group±s，n＝10）**P＜0.01 vs control group

2.2 小鼠心室HE和M asson染色結(jié)果 HE染色和Masson染色結(jié)果如Fig 3和Fig 4A所示，溶媒對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，形狀基本一致；模型組心肌細(xì)胞間可見(jiàn)有較多的纖維組織。CVF計(jì)算結(jié)果顯示，模型組較溶媒對(duì)照組明顯增加（P＜0.01），見(jiàn) Fig 4B。

Fig 3 Com parison of histopathological changes ofm yocardial tissues from control group and model group（HE staining，400×）A：Control group；B：Model group

Fig 4 Comparison of histopathological changes ofmyocardial tissues from control group and model group by Masson staining（40×）a：Control group；b：Model group；B：CVF（xˉ±s，n＝10）.**P＜0.01 vs control group

2.3 心肌CollagenⅠ mRNA的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組CollagenⅠmRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.01），見(jiàn) Fig 5。

Fig 5 Com parison of CollagenⅠm RNA expression in the left ventricle from control group and model group（xˉ±s，n＝10）**P＜0.01 vs control group

3 討論

異丙腎上腺素在誘導(dǎo)小鼠心肌纖維化的過(guò)程中，通過(guò)激活RAAS系統(tǒng)，明顯增加血漿中腎素、醛固酮和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）活性［9］，增加血漿中血管緊張素Ⅱ，而醛固酮通過(guò)鹽皮質(zhì)受體增加心肌AT l受體水平［10］，進(jìn)而血管緊張素Ⅱ通過(guò)激活A(yù)Tl受體降低心肌成纖維細(xì)胞中膠原酶的活性［11］，最終增加心肌間質(zhì)膠原的合成，促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展［12-13］。

我們通過(guò)前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)和本研究發(fā)現(xiàn)，在用異丙腎上腺素制備小鼠心肌纖維化模型的過(guò)程中，異丙腎上腺素皮下注射的劑量、間隔時(shí)間和環(huán)境溫度是模型成功與否的3個(gè)關(guān)鍵因素。異丙腎上腺素是β受體激動(dòng)劑，作用于心臟β1受體，使心肌收縮力增強(qiáng)、心率加快、心輸出量和心肌耗氧量增加。異丙腎上腺素皮下注射劑量過(guò)大，是導(dǎo)致小鼠死亡的直接原因。但是，若是皮下注射異丙腎上腺素劑量過(guò)小，小鼠通過(guò)自身代償機(jī)制，又不容易形成纖維化。因此，如何選擇一種合適的劑量，使小鼠容易形成心肌纖維化，又不致死，是該模型能否成功的關(guān)鍵因素之一。我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)的研究中，異丙腎上腺素首先從40 mg·kg-1初始劑量皮下注射開(kāi)始摸索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每次皮下注射后都會(huì)有不同數(shù)量的小鼠死亡，隨著給藥天數(shù)的增加，最后存活的小鼠所剩無(wú)幾。所以，我們逐漸降低異丙腎上腺素的給藥劑量，最后發(fā)現(xiàn)，首劑給予沖擊劑量5 mg·kg-1，后以2.5 mg·kg-1維持 30 d，每天同一時(shí)間注射1次，是小鼠不致死又能造成心肌纖維化模型的適當(dāng)劑量和給藥間隔。心肌纖維化時(shí)，心肌組織中膠原纖維過(guò)量積聚，心肌膠原主要包括CollagenⅠ和CollagenⅢ，其中CollagenⅠ約占膠原總量的80%～85%，通過(guò)測(cè)定心肌組織Hydro含量來(lái)作為心肌纖維化的標(biāo)志［14］（1 g Hydro相當(dāng)于8.2 g膠原蛋白）［15］，肉眼可以觀察到心臟體積和重量的增加（用CWI表示）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在該注射方案下，心肌纖維化模型組小鼠的CWI、Hydro含量以及CollagenⅠmRNA表達(dá)明顯增加，HE和Masson染色可更加直觀地看出模型組小鼠心肌組織中的膠原明顯增加，心肌細(xì)胞排列不整齊，心肌細(xì)胞間可見(jiàn)有較多的纖維組織。另外，環(huán)境溫度控制也非常關(guān)鍵，環(huán)境溫度過(guò)高，加快異丙腎上腺素的吸收，也容易導(dǎo)致小鼠的死亡，尤其是在天氣炎熱的季節(jié)，更應(yīng)嚴(yán)格控制動(dòng)物房?jī)?nèi)的環(huán)境溫度。一般將溫度控制在18～22℃之間為宜。

本研究通過(guò)皮下注射異丙腎上腺素成功制備了小鼠心肌纖維化模型，相比于其他造模的方法，該方法不需要開(kāi)腹、開(kāi)胸，損傷小，死亡率很低；用小鼠做實(shí)驗(yàn)更加易于操作；同時(shí)，該方法制備的模型符合缺血性心肌損傷的病理進(jìn)程，是制備心肌纖維化理想的動(dòng)物模型，為心肌纖維化的研究提供了一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、可靠的小鼠模型。

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