蘭燕宇，劉 躍，曹 旭，牟景麗，王愛民，鄭 林

（貴陽醫(yī)學(xué)院1.藥學(xué)院貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州貴陽 550004）

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）又名木綿、思仙、思仲、絲棉皮、扯絲皮、川杜仲等，為杜仲科植物杜仲屬的落葉喬木。其皮、莖、葉均可入藥，是一味名貴中藥材，主要產(chǎn)于貴州、四川、湖北、浙江等?。?］。國(guó)內(nèi)外對(duì)杜仲的化學(xué)成分和藥理作用的研究已取得很大的進(jìn)展，研究結(jié)果表明，其中木脂素類化合物（松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇單葡萄糖苷）是杜仲的主要降壓部位，能較好地代表杜仲的整體效應(yīng)，其降壓作用確切，具有良好的開發(fā)前景，另京尼平苷酸具有預(yù)肪性功能低下、增強(qiáng)記憶功能、抗癌、抗氧化、瀉下、促進(jìn)膽汁分泌及降壓作用［2］。Caco-2細(xì)胞系（human colon carcinoma cell line）來源于人結(jié)腸腺癌細(xì)胞，容易在體外培養(yǎng)，其同源性較好，結(jié)構(gòu)和生化作用類似于人小腸上皮細(xì)胞，含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶系，可獲得藥物的攝取、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝等信息［3］。把Caco-2細(xì)胞模型作為體外中藥復(fù)方藥效研究的“藥篩”工具，將中藥中大量不能被吸收的復(fù)雜成分在體外實(shí)驗(yàn)前先行“篩”去，以此增加中藥復(fù)方制劑體外實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的相關(guān)性。因此，本試驗(yàn)采用Caco-2細(xì)胞模型，結(jié)合UPLC-MS/MS法考察杜仲提取物中主要成分松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷苷、京尼平苷酸、原兒茶酸在Caco-2細(xì)胞中的攝取特點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，以期為杜仲提取物的口服制劑研發(fā)提供一定的科學(xué)依據(jù)，并為中藥的體外吸收機(jī)制研究提供參考［4-5］。

1 材料

1.1 儀器 超高液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Waters公司）；Allegra 64R高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）；ZH-2渦旋混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；CQ 250A-TS超聲波清洗機(jī)（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo scientific）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備總廠）；Millicell-ERS電位儀（美國(guó) Millipore公司）；功能酶標(biāo)儀（Thermo3001 VARIOSKAN FLASH）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus）；TGL-16G離心機(jī)。

1.2 試劑與試藥 京尼平苷酸（批號(hào)27741-01-1）、松脂醇二葡萄糖苷（批號(hào)201206）、松脂醇單葡萄糖苷（批號(hào)070801）、原兒茶酸（批號(hào) X20-20121012）和葛根素（批號(hào)110752-200912）對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；杜仲提取物自制（批號(hào)：20130823）；DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium，Gibco）、胎牛血清（fetal bovine seurm，Biochrom）、青、鏈霉素、Hank′s緩沖溶液（HBSS，Gibco）；胰蛋白酶（Trypsin，Sigma）；考馬斯亮藍(lán)（20130523，南京建成生物工程研究所）；DMSO、甲醇、乙腈均為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞株 Caco-2細(xì)胞株（上海中科院），實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞傳代數(shù)在50代以內(nèi)。

Fig 1 SIR chromatogramsA：Blank cell suspension；B：Blank cell suspension spiked with standands；C：Caco-2 cell sample；1：Geniposidic acid；2：Protocatechuic acid；3：Puerarin；4：Pinoresinol diglucoside；5：Pinoresinol singleglucoside

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)胞攝取特性考察方法［6-8］參照文獻(xiàn)［9］方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，將培養(yǎng)14 d的細(xì)胞用37℃、pH 7.4的HBSS緩沖溶液在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min后，吸去緩沖溶液。用HBSS緩沖溶液輕輕沖洗兩遍，洗去細(xì)胞單分子層表面的雜質(zhì)。加入含藥的HBSS溶液2 ml，置37℃的培養(yǎng)箱中，分別考察培養(yǎng)時(shí)間（15、30、60、90、120、180 min）、不同濃度（0.2、0.5、1、2、5 g·L-1）、培養(yǎng)介質(zhì)不同 pH（4.0、5.0、6.0、7、8）、不同溫度（4、25、37）℃以及抑制劑（P-糖蛋白抑制劑維拉帕米、頭孢菌素A）對(duì)杜仲提取物細(xì)胞攝取的影響。按攝取時(shí)間取出后，加入4℃的HBSS快速清洗3遍細(xì)胞單分子層，加入0.1%Triton X-100（pH 7.4的HBSS溶液配制）細(xì)胞裂解液500μl，反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，取出細(xì)胞超聲10 min，得細(xì)胞懸液。取300μl細(xì)胞懸液，加入10μl內(nèi)標(biāo)，300μl甲醇沉淀蛋白，渦混1 min，15 000 r·min-1離心5 min，取上清2μl進(jìn)樣分析，測(cè)定京尼平苷酸等4種成分的濃度；另取10μl細(xì)胞懸液以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量。攝取量以mg（藥物）/g（蛋白）表示。

2.2 分析條件 色譜條件：Waters Acquity BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）色譜柱；0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫，梯度為0～0.5 min：5%～10%，0.5～3.5 min：10% ～20%，3.5～4 min：20% ～90%，4～5 min：90%～5%，；流速為0.35 ml·min-1；柱溫：45℃。進(jìn)樣體積為2μl。

質(zhì)譜條件：Waters Acquity TQD質(zhì)譜儀，MassL-ynxV4.1工作站，電噴霧電離源（ESI）；毛細(xì)管電壓：3kV；離子源溫度：120℃；去溶劑氣溫度：350℃；去溶劑氣為氮?dú)猓?50 L· h-1）；碰撞氣為氬氣（0.16 ml·min-1）；掃描方式為選擇離子監(jiān)測(cè)模式（SIR），用于定量分析的京尼平苷酸、原兒茶酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷及葛根素（內(nèi)標(biāo)）監(jiān)測(cè)離子反應(yīng)分別 m/z 373.2；m/z 152.9；m/z 681.3；m/z 519.3；m/z 417.0。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取京尼平苷酸、原兒茶酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷適量，用甲醇定容至10 ml，獲得京尼平苷酸（1.350 g·L-1）、原兒茶酸（0.974 g·L-1）、松脂醇二葡萄糖苷（1.000 g·L-1）、松脂醇單葡萄糖苷（1.010 g·L-1）的儲(chǔ)備液。置冰箱（-20℃）保存，備用。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 比較空白細(xì)胞混懸液A、混合對(duì)照品溶液B和細(xì)胞樣品C的色譜行為，在建立的色譜條件下考察其專屬性。京尼平苷酸等4種成分及葛根素（內(nèi)標(biāo)）的保留時(shí)間（RT）分別為 0.99、1.08、1.83、2.40、3.73 min，由 Fig 1可以看出，成分間分離良好，空白細(xì)胞混懸液無雜質(zhì)干擾。

2.4.2 線性關(guān)系的考察 取空白細(xì)胞混懸液300 μl，依次加入50μl混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，10μl內(nèi)標(biāo)溶液及300μl甲醇沉淀蛋白，其余按“2.1”項(xiàng)下操作，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測(cè)物的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（A/Ai）為縱坐標(biāo)Y，各物質(zhì)濃度（C）為橫坐標(biāo)X進(jìn)行直線回歸，權(quán)重系數(shù)為1/X，求得直線方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。京尼平苷酸（Y＝1.158X＋0.56，r＝0.995，0.07～15.98 mg·L-1），原兒茶酸（Y＝2.50X＋0.01，r＝0.997，0.02～5.76 mg·L-1），松脂醇二葡萄糖苷（Y＝0.55X＋0.06，r＝0.996，0.05～11.83 mg·L-1），松脂醇單葡萄糖苷（Y＝1.46X-0.16，r＝0.995，0.05～11.95 mg·L-1），各成分最低檢測(cè)限（LOD）分別為 3.30、10.27、17.41、11.67 mg·L-1。

2.4.3 準(zhǔn)確度和精密度 按“標(biāo)準(zhǔn)曲線”項(xiàng)下分別配制4個(gè)成分的低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)量控制樣品（QC），每一個(gè)濃度進(jìn)行5樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 d，代入當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線中，分別計(jì)算各物質(zhì)的濃度，求算日間RSD%和準(zhǔn)確度。每一個(gè)濃度進(jìn)行5樣本分析，日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)進(jìn)行。求得京尼平苷酸等4個(gè)成分準(zhǔn)確度為88.99%～105.15%；日內(nèi)精密度RSD%為1.29%～13.29%；日間精密度RSD%為1.60%～5.36%。

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 用空白細(xì)胞混懸液配置上述高濃度的混標(biāo)溶液，室溫放置，分別在1、2、3 d，在所確定的質(zhì)譜條件下分析，根據(jù)京尼平苷酸、原兒茶酸、松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇單葡萄糖苷色譜峰面積，計(jì)算其RSD分別為0.33%、3.23%、4.08%和2.43%。結(jié)果表明，杜仲提取物樣品溶液在3 d內(nèi)室溫放置條件下穩(wěn)定性均良好。

2.4.5 回收率 按“標(biāo)準(zhǔn)曲線”項(xiàng)下配制低、中、高濃度同時(shí)含4種成分的溶液，但不加入內(nèi)標(biāo)，所確定的質(zhì)譜條件下分析，每個(gè)濃度重復(fù)3次，經(jīng)LC-MS/MS測(cè)定值與相應(yīng)濃度直接用流動(dòng)相配制的樣品溶液測(cè)定值的比值計(jì)算回收率?；厥章示笥?5%。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)分析所得數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，組間差異比較用t檢驗(yàn)。多組比較，用單因素方差分析。

2.6 Caco-2細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 不同濃度受試化合物對(duì)Caco-2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Caco-2細(xì)胞，以每孔100μl，1×108～2×108個(gè)·L-1種植于96孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、藥物組。正常對(duì)照組每孔加入100 μl DMEM培養(yǎng)液；藥物組：將杜仲提取物稀釋至不同體積比濃度：0.5、5、10、20、40 g·L-1，每孔加入100μl，作用Caco-2細(xì)胞4 h后，用MTT法檢測(cè)。每個(gè)濃度平行5孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率/%＝（對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD）/對(duì)照組OD×100%。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在所設(shè)置的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，杜仲提取物對(duì)Caco-2細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，提取物濃度在5 g·L-1以上時(shí)有細(xì)胞毒性（P＜0.05），因此，實(shí)驗(yàn)選擇濃度在5 g·L-1以下進(jìn)行下一步的攝取實(shí)驗(yàn)。

2.6.2 濃度依賴性攝取實(shí)驗(yàn) 取不同濃度（0.2、0.5、1、2.5、5 g·L-1）的杜仲提取物的 Hank′s溶液，然后加入Caco-2細(xì)胞中，培養(yǎng)60 min，考察藥物濃度對(duì)細(xì)胞攝取的影響。結(jié)果表明，在0.2～5 g·L-1內(nèi)杜仲提取物中的京尼平苷酸等4個(gè)成分的細(xì)胞攝取量與濃度呈線性關(guān)系，其回歸相關(guān)系數(shù)（r2）均達(dá)到0.990以上，表明京尼平苷酸等4種成分的攝取主要表現(xiàn)為被動(dòng)擴(kuò)散。結(jié)果見Fig 2。

Fig 2 Effect of extract with different concentrations on uptake by Caco-2 cellmonolayers

2.6.3 不同時(shí)間對(duì)Caco-2細(xì)胞攝取的影響 將5 g·L-1杜仲提取物加到細(xì)胞中，分別考察不同攝取時(shí)間（15、30、60、90、120、180 min）對(duì) Caco-2細(xì)胞攝取的影響。結(jié)果顯示，在不同的攝取時(shí)間下，杜仲提取物中的京尼平苷酸、松脂醇單葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷3個(gè)成分的細(xì)胞攝取量都隨著時(shí)間的增加而攝取增加，而原兒茶酸隨著時(shí)間的增加攝取量緩慢降低。綜合此結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞攝取時(shí)間定為60 min。結(jié)果見Fig 3。

2.6.4 pH值對(duì)Caco-2細(xì)胞攝取的影響 將5 g·L-1杜仲提取物分別溶于不同 pH（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）的 Hank′s中，在加藥 60 min后測(cè)定不同pH值對(duì)Caco-2細(xì)胞攝取杜仲提取物的影響。結(jié)果表明，在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0條件下，杜仲提取物中的京尼平苷酸、原兒茶酸、松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇單葡萄糖苷4個(gè)成分的細(xì)胞攝取量隨著pH的增加，攝取量逐漸降低。結(jié)果表明，堿性環(huán)境不利于京尼平苷酸等4種成分的吸收，再考慮到小腸的吸收環(huán)境，實(shí)驗(yàn)選擇pH 6作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的pH環(huán)境。結(jié)果如Fig 4所示。

Fig 3 Time-dependent effect of extract on uptake by Caco-2 cellmonolayers

Fig 4 pH-dependent effect of extract on uptake by Caco-2 cellmonolayers

2.6.5 不同溫度對(duì)Caco-2細(xì)胞攝取的影響 將5 g·L-1杜仲提取物加到培養(yǎng)好的細(xì)胞中，分別在pH 6、加藥60 min后測(cè)定不同溫度（4、25、37℃）對(duì) Caco-2細(xì)胞攝取杜仲提取物的影響。結(jié)果表明，在不同溫度下，杜仲提取物中的京尼平苷酸等4個(gè)成分的細(xì)胞攝取量都隨著溫度的增加而增加，37℃環(huán)境下更有利于細(xì)胞的攝取。結(jié)果如Fig 5所示。

2.6.6 抑制劑對(duì)Caco-2細(xì)胞攝取的影響［10］按上述所確定的pH 6、37℃作為攝取條件，分別加入含同濃度的杜仲提取物（5g·L-1）溶液、含維拉帕米（25 mg·L-1）的杜仲提取物溶液、含環(huán)孢菌素A（10 mg·L-1）的杜仲提取物溶液，分別于給藥60 min后，測(cè)定有無抑制劑存在時(shí)Caco-2細(xì)胞對(duì)杜仲提取物攝取的變化，數(shù)據(jù)用ˉx±s表示，采用SPSS 18軟件，統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析。結(jié)果見Tab 1。

Fig 5 Tem perature-dependent effect of extract on uptake by Caco-2 cellmonolayers

Tab 1 Effect of cyclosporine A and verapam il on uptake byCaco-2 cellmonolayers（±s，n＝3）

Tab 1 Effect of cyclosporine A and verapam il on uptake byCaco-2 cellmonolayers（±s，n＝3）

*P＜0.05 compared with extract.

Composition Uptake/mg·g-1Pro Geniposidic acid 1.08±0.06 Cyclosporine A＋Geniposidic acid 1.04±0.06 Verapamil＋Geniposidic acid 1.08±0.08 Protocatechuic acid 0.4±0.03 Cyclosporine A＋Protocatechuic acid 0.46±0.02*Verapamil＋Protocatechuic acid 0.52±0.04*Pinoresinol diglucoside 1.98±0.14 Cyclosporine A＋Pinoresinol diglucoside 1.89±0.09 Verapamil＋Pinoresinol diglucoside 2.04±0.12 Pinoresinol singleglucoside 0.61±0.01 Cyclosporine A＋Pinoresinol singleglucoside 0.59±0.03 Verapamil＋Pinoresinol singleglucoside 0.61±0.02

3 討論

藥物口服后，小腸是主要的吸收部位，目前應(yīng)用較多的腸吸收實(shí)驗(yàn)方法有：在體腸灌流法（in situ intestinal perfusion）、外翻腸環(huán)法（evetred intestinal rings）、外翻腸囊法（evetred gut sacs）和 Caco-2細(xì)胞模型法（Caco-2 cell model）等［11］。其中，Caco-2細(xì)胞是研究藥物腸吸收的理想模型，因接近藥物在人體內(nèi)吸收的實(shí)際環(huán)境，并具有較高的重現(xiàn)性，兼具快速、易于控制、干擾小、可連續(xù)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，而成為近年來國(guó)際公認(rèn)的用于高通量研究藥物腸吸收的常用工具模型［12］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，杜仲提取物在0.2～5 g·L-1內(nèi)，攝取量受時(shí)間、濃度、pH的影響，Caco-2細(xì)胞的攝取量與藥物濃度呈良好的線性關(guān)系，由于在各自相應(yīng)濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞攝取表現(xiàn)出一級(jí)速率過程的特征，表明杜仲提取物的攝取機(jī)制可能為被動(dòng)擴(kuò)散。在酸性環(huán)境下有利于京尼平苷酸等4種成分的攝取，在中性、偏堿性條件下，藥物的攝取明顯降低。這可能是由于京尼平苷酸等具有酚羥基結(jié)構(gòu)，顯弱酸性，所以中性、偏堿性條件下水解為鹽的形式，從而導(dǎo)致膜滲透性降低。隨著溫度的增加，細(xì)胞內(nèi)酶的活性增加，細(xì)胞攝取量也隨之增加。

Caco-2細(xì)胞表達(dá)多種主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)載體如P-gp、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP2）等。P-gp可將其底物藥排出細(xì)胞，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，P-gp抑制劑可抑制P-gp的外排功能，增加P-gp底物的細(xì)胞內(nèi)濃度。本實(shí)驗(yàn)采用Caco-2細(xì)胞攝取方法考察京尼平苷酸等4種成分是否是P-gp的底物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，環(huán)孢菌素A和維拉帕米對(duì)京尼平苷酸等3種成分的攝取量沒有明顯增加作用，說明京尼平苷酸等3種成分的攝取過程中沒有P-gp的參與，而原兒茶酸細(xì)胞攝取量明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），即京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷和松脂醇單葡萄糖苷不是P-gp的底物，原兒茶酸是P-gp的底物。

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