司徒永立，柯 行，劉 義，呂思敏，鐘月春，崔 燎，吳 鐵

（1.廣東醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)研究所，2.廣東醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，3.廣東天然藥物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524023）

骨質(zhì)疏松是一種以骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)退變?yōu)樘卣?，致使骨脆性和骨折危險(xiǎn)性增加的系統(tǒng)性骨骼疾?。?］。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松主要是由于隨著年齡的增長(zhǎng)，女性絕經(jīng)后雌激素缺乏所引起，它是絕經(jīng)后婦女常見(jiàn)病、多發(fā)病。目前骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的建立有多種方法，如去卵巢致骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型、糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型、環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型等，各種骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型都有其特點(diǎn)，可用于相應(yīng)骨質(zhì)疏松癥的研究，但其不足之處我們必須引起重視。

D-半乳糖常用于衰老動(dòng)物模型的建立，近年來(lái)，D-半乳糖對(duì)小鼠骨組織的研究已有一些報(bào)道，但研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖對(duì)小鼠骨量的影響結(jié)果不一，覃冬云等［2］研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖能導(dǎo)致♀小鼠發(fā)生骨質(zhì)疏松；但羅紅梅等［3］研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖可提高♀小鼠礦化程度。本研究旨在探討D-半乳糖對(duì)♀小鼠是否會(huì)產(chǎn)生骨質(zhì)疏松，這種骨質(zhì)疏松與去卵巢導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松有何異同？去卵巢后再加上D-半乳糖是否會(huì)加速加重骨質(zhì)疏松的進(jìn)展？補(bǔ)充雌激素對(duì)這些骨質(zhì)疏松是否有預(yù)防作用？

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 己烯雌酚片：合肥久聯(lián)有限公司，批號(hào)：20100920；D-半乳糖：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：20090921；鈣黃綠素、鹽酸四環(huán)素：美國(guó)Sigma公司。

1.2 動(dòng)物分組、給藥及實(shí)驗(yàn)方法 60只2月齡SPF級(jí)昆明♀小鼠，由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（粵）2008-0008。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分成6組，分別為假手術(shù)組（S）、D-半乳糖組（D）、去卵巢組（O）、去卵巢 ＋D-半乳糖組（O＋D）、去卵巢＋D-半乳糖＋己烯雌酚組（O＋D＋d）和D-半乳糖＋己烯雌酚組（D＋d）。O組、O＋D組、O＋D＋d組進(jìn)行雙側(cè)去卵巢手術(shù)，其余組做假手術(shù)對(duì)照，休養(yǎng)2 d后給藥。D組和O＋D組皮下注射D-半乳糖120 mg·kg-1·d-1，O＋D＋d組和D＋d組皮下注射D-半乳糖120 mg·kg-1·d-1，灌胃給予己烯雌酚 0.038 mg·kg-1·d-1，其余組皮下注射、灌胃給予等量蒸餾水，所有小鼠于處死前d 10～11和d 3～4分別皮下注射鹽酸四環(huán)素35 mg·kg-1、鈣黃綠素7.5 mg·kg-1，進(jìn)行熒光標(biāo)記，全程自由飲食，每周稱重1次，實(shí)驗(yàn)周期為70 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，頸椎脫臼處死小鼠，右脛骨按文獻(xiàn)［4］步驟，進(jìn)行不脫鈣包埋切片、染色，并以生長(zhǎng)板下0.5 mm到2 mm為測(cè)量范圍，對(duì)上述范圍的松質(zhì)骨進(jìn)行測(cè)量、計(jì)算和分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行ANOVA單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)以ˉx±s表示。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體重觀察 各組小鼠體重見(jiàn)Fig 1，由Fig 1可見(jiàn)：與D組比較，D＋d組第3、5、8周體重降低（P＜0.05）。與O＋D組比較，O＋D＋d組第7、8、9周體重降低（P＜0.01）。

Fig 1 Body weight in m ice（±s，n＝10）*P＜0.05，**P＜0.01 vs S group，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs D group；ΔP＜0.05；ΔΔP＜0.01 vs O＋D group

2.2 各組小鼠脛骨上段骨小梁面積與骨小梁形態(tài)觀察 從Fig 2可見(jiàn)，S組骨小梁結(jié)構(gòu)緊密、粗而均勻，連續(xù)性好，數(shù)量多；D組骨小梁結(jié)構(gòu)稀疏，變細(xì)、斷裂，不連續(xù)，數(shù)量減少；O組只剩下一小部分的斷裂骨小梁，出現(xiàn)大量無(wú)骨小梁骨髓區(qū)；O＋D組也只剩下一小部分的斷裂骨小梁，出現(xiàn)大量無(wú)骨小梁骨髓區(qū)；O＋D＋d組較O＋D組骨小梁面積有所增大，數(shù)量有所增加，但結(jié)構(gòu)較稀疏；D＋d組骨小梁較D組結(jié)構(gòu)緊密，明顯增粗、增大，連續(xù)性較好，數(shù)量明顯增加。

2.3 各組小鼠脛骨上段骨形態(tài)計(jì)量學(xué)靜態(tài)指標(biāo)觀察 從Tab 1可見(jiàn)：與S組比較，O組骨小梁面積百分?jǐn)?shù)（%Tb.Ar）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）分別降低了50.4%、25.4%、50.9%（P＜0.01），骨小梁分離度（Tb.Sp）升高了169.4%（P＜0.05）。O＋D組%Tb.Ar、Tb.N、Tb.Th分別減低了46.2%（P＜0.01）、48.6%（P＜0.01）、21.0%（P＜0.05），Tb.Sp升高了131.7%（P＜0.05）。與 O＋D組比較，O＋D＋d組%Tb.Ar、Tb.N、Tb.Th分別升高了 122.3%（P＜0.01）、79.1%（P＜0.01）、27.5%（P＜0.05），Tb.Sp降低了 54.2%（P＜0.05）。與 D組比較，D＋d組%Tb.Ar、Tb.N分別升高了108.8%（P＜0.01）、68.4%（P＜0.05），Tb.Sp降低了57.5%（P＜0.01）。

Tab 1 Static parameters of bonemorphology in tibia（±s，n＝10）

Tab 1 Static parameters of bonemorphology in tibia（±s，n＝10）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs Sgroup；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs D group；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 vs O＋Dgroup

G r o u p %T b.A r/%T b.T h/μ m T b.N/n o.·m m-1 T b.S p/μ m S 7.1 6±1.9 9 4 3.3±8.2 8 2.1 4±0.5 7 2 4 5 4±1 2 2 D 4.9 8±1.9 2 4 2.4±1 0.1 1.5 5±0.9 3 5 8 8 1±4 8 9 O 3.5 5±1.8 7**3 2.3±6.0 0**1.0 5±0.4 5 8** 1 2 2 3±7 6 4*O＋D 3.8 5±1.5 8**3 4.2±5.0 4* 1.1 0±0.3 6 1**1 0 5 2±5 7 3*O＋D＋d 8.5 6±3.4 7 ΔΔ 4 3.6±8.1 4 Δ 1.9 7±0.7 8 3 ΔΔ 4 8 2±1 7 4 Δ D＋d 1 0.4±3.3 5＃＃ 3 9.8±6.7 8 2.6 1±0.7 0 5＃ 3 7 4±1 1 4＃＃

Fig 2 Trabecular area and trabecular morphology in tibiaSgroup：A1，A2；D group：B1，B2；O group：C1，C2；O＋D group：D1，D2；O＋D＋d group：E1，E2；D＋d group：F1，F(xiàn)2；Toluidine blue staining，A1～F1：4×，A2～F2：20×

2.4 各組小鼠脛骨上段破骨細(xì)胞形態(tài)及骨吸收靜態(tài)指標(biāo)觀察

2.4.1 各組小鼠脛骨上段破骨細(xì)胞形態(tài)觀察 從Fig 3可見(jiàn)，S組破骨細(xì)胞附著骨表面，未發(fā)生極化現(xiàn)象，并未開(kāi)始侵蝕骨小梁。D組破骨細(xì)胞已附著骨表面，與骨表面處較模糊，出現(xiàn)極化、皺褶緣或偽足，開(kāi)始侵蝕骨小梁。O組破骨細(xì)胞位于Howship陷窩的骨表面，與骨表面處模糊不清，出現(xiàn)極化、皺褶緣或偽足，較深地侵蝕骨表面。O＋D組破骨細(xì)胞位于Howship陷窩的骨表面，與骨表面處模糊不清，出現(xiàn)極化、皺褶緣或偽足，較深地侵蝕骨表面。O＋D＋d組破骨細(xì)胞附著骨表面，形成Howship陷窩不明顯，極化、皺褶緣或偽足跡象較弱。D＋d組破骨細(xì)胞附著骨表面，形成Howship陷窩不明顯，極化、皺褶緣或偽足跡象較弱。

2.4.2 各組小鼠脛骨上段骨吸收的靜態(tài)指標(biāo)觀察各組小鼠脛骨上段骨吸收的靜態(tài)指標(biāo)見(jiàn)Tab 2，由Tab 2可見(jiàn)：與S組比較，D組破骨細(xì)胞周長(zhǎng)（Oc.Pm）、破骨細(xì)胞數(shù)（Oc.No.）、破骨細(xì)胞周長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)（%Oc.S）、每毫米破骨細(xì)胞數(shù)（Oc.N/mm）分別升高了 105.7%（P＜0.01）、109.2%（P＜0.05）、125.8%（P＜0.05）、139.2%（P＜0.05）。O組 Oc.Pm、Oc.No.、%Oc.S、Oc.N/mm 分 別 升 高 了204.3%、248.7%、389.6%、508.4%（P＜0.01）。O＋D組 Oc.Pm、Oc.No.、%Oc.S、Oc.N/mm分別升高了 227.2%、327.4%、268.7%、410.2%（P＜0.01）。與D組比較，O組Oc.Pm、Oc.No.、%Oc.S、Oc.N/mm分別升高了47.9%（P＜0.01）、66.7%（P＜0.01），116.8%（P＜0.05）、154.4%（P＜0.05）。O＋D組Oc.Pm升高了59.1%（P＜0.05）。D＋d組 Oc.Pm、%Oc.S、Oc.N/mm分別降低了57.5%、79.9%、66.2%（P＜0.01）。與O＋D組比較，O＋D＋d組 Oc.Pm、Oc.No.、%Oc.S、Oc.N/mm分別降低了59.1%、47.4%、74.2%、65.6%（P＜0.01）。

Fig 3 M orphology of osteoclast in tibiaSgroup：A；D group：B；O group：C；O＋D group：D；O＋D＋d group：E；D＋d group：F；Toluidine blue staining（20×）

Tab 2 Static parameters of bone resorption in tibia（±s，n＝10）

Tab 2 Static parameters of bone resorption in tibia（±s，n＝10）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs Sgroup；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs Dgroup；ΔΔP＜0.01 vs O＋D group；□□P＜0.01 vs O＋D＋d group.

G r o u p O c.P m/m m O c.N o./N o. %O c.S/% O c.N/m m/N·m m-1 S 0.0 4 3 7±0.0 3 2 8 0.8 8 9±0.7 3 7 0.8 6 8±0.7 4 3 0.1 6 6±0.1 3 2 D 0.0 8 9 9±0.0 2 2 5**1.8 6±0.6 3 9* 1.9 6±0.9 6 9* 0.3 9 7±0.2 0 5*O 0.1 3 3±0.0 2 8 3**＃＃3.1 0±0.9 4 3**＃＃ 4.2 5±2.2 6**＃ 1.0 1±0.5 8 8**＃O＋D 0.1 4 3±0.0 3 2 9**＃ 3.8 0±1.0 8** 3.2 0±1.1 7** 0.8 4 7±0.3 1 4**O＋D＋d 0.0 5 8 5±0.0 2 4 5＃ΔΔ 2.0 0±0.6 6 7**ΔΔ 0.8 2 6±0.2 9 7＃＃ΔΔ 0.2 9 1±0.0 8 9 9*ΔΔ D＋d 0.0 3 8 2±0.0 3 3 8＃＃ 1.3 0±1.1 0 0.3 9 4±0.2 9 9＃＃□□ 0.1 3 4±0.0 9 6 5＃?！酢?/p>

2.5 各組小鼠脛骨上段成骨細(xì)胞形態(tài)觀察 各組小鼠脛骨上段成骨細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)Fig 4，由Fig 4可見(jiàn)，S組成骨細(xì)胞在骨表面排列緊密，呈圓柱形，其下面貼近骨表面處可見(jiàn)一層較厚嗜酸性的類(lèi)骨質(zhì)。D組成骨細(xì)胞在骨表面排列稀疏，呈扁平狀，其分泌嗜酸性類(lèi)骨質(zhì)較少。O組成骨細(xì)胞在骨表面排列稀疏，呈扁平狀，其分泌嗜酸性類(lèi)骨質(zhì)少。O＋D組成骨細(xì)胞在骨表面排列稀疏，呈扁平狀，其分泌嗜酸性類(lèi)骨質(zhì)少。O＋D＋d組成骨細(xì)胞在骨小梁表面排列較緊密，呈圓柱形，其分泌嗜酸性類(lèi)骨質(zhì)較多。D＋d組成骨細(xì)胞在骨小梁表面排列較緊密，呈圓柱形，其分泌嗜酸性類(lèi)骨質(zhì)較多。

Fig 4 M orphology of osteoblast in tibiaSgroup：A；D group：B；O group：C；O＋D group：D；O＋D＋d group：E；D＋d group：F；Toluidine blue staining（20×）

2.6 各組小鼠脛骨上段骨形成動(dòng)態(tài)指標(biāo)觀察 與S組比較，O組單標(biāo)記周長(zhǎng)（sL.Pm）、雙標(biāo)記周長(zhǎng)（dL.Pm）、雙標(biāo)記間距（Ir.L.Wi）、標(biāo)記周長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)（%L.Pm）分別降低了 77.3%、91.7%、68.9%、73.4%（P＜0.01）。O＋D組 sL.Pm、dL.Pm、Ir.L.Wi、%L.Pm分別降低了 56.6%、74.2%、34.4%、46.1%（P＜0.05）。與D組比較，O組 sL.Pm、dL.Pm、Ir.L.Wi、%L.Pm分別降低了 64.5%（P＜0.01）、68.8%（P＜0.01）、59.2%（P＜0.01）、59.5%（P＜0.05）。O＋D組sL.Pm降低了32.1%（P＜0.05），D＋d組 sL.Pm、dL.Pm分別升高了104.7（P＜0.01）、99.0%（P＜0.05）。與 O＋D組比較，O＋D＋d組 sL.Pm、dL.Pm、Ir.L.Wi、%L.Pm分別升高了 118.0%（P＜0.01）、106.4%（P＜0.01）、46.6%（P＜0.05）、49.4%（P＜0.05），見(jiàn)Tab 3。

Tab 3 Dynam ic parameters of bone formation in tibia（±s，n＝10）

Tab 3 Dynam ic parameters of bone formation in tibia（±s，n＝10）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs Sgroup；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs Dgroup；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 vs O＋Dgroup；□□P＜0.01 vs O＋D＋d group.

Group sL.Pm/mm dL.Pm/mm Ir.L.Wi/μm %L.Pm/%S 0.871±0.561 0.361±0.337 16.21±5.381 11.9±6.77 D 0.557±0.163 0.096±0.041 12.37±5.569 7.82±3.86 O 0.198±0.185**＃＃0.030±0.026**＃＃ 5.05±4.234**＃＃ 3.17±3.02**＃O＋D 0.378±0.132*＃ 0.093±0.043* 10.79±3.607* 6.42±2.64*O＋D＋d 0.824±0.173＃＃ΔΔ 0.192±0.054＃＃ΔΔ 15.82±3.871Δ 9.59±3.57Δ D＋d 1.14±0.277＃＃□□ 0.191±0.085＃15.82±4.430 8.36±1.45

2.7 各組小鼠脛骨上段骨形成熒光及動(dòng)態(tài)指標(biāo)觀察

2.7.1 各組小鼠脛骨上段骨形成熒光觀察 S組熒光多、亮，雙熒光間距較大。D組熒光少，比較暗淡，只見(jiàn)單熒光。O組和O＋D組熒光少且弱。O＋D＋d組較O＋D組熒光有所改善，雙熒光間距較小，但比較模糊、暗淡。D＋d組較D-半乳糖組有所改善，可見(jiàn)雙熒光且間距較大，但還是比較模糊、暗淡，見(jiàn) Fig 5。

2.7.2 各組小鼠脛骨上段骨生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)指標(biāo)觀察與S組比較，D組骨礦化沉積率（MAR）、骨形成率（BFR/TV、BFR/BV、BFR/BS）分別降低了44.4%、77.0%、78.2%、74.6%（P＜0.05）。O組MAR、BFR/TV、BFR/BV、BFR/BS分別降低了73.2%、95.7%、93.5%、94.1%（P＜0.01）。O＋D組 MAR、BFR/TV、BFR/BV、BFR/BS分別降低了40.1%（P＜0.05）、79.0%（P＜0.01）、73.0%（P＜0.05）、63.6%（P＜0.01）。與D組比較，O組MAR、BFR/TV、BFR/BV、BFR/BS分別降低了 51.9%（P＜0.05）、81.1%（P＜0.05）、70.3%（P＜0.01）、76.7%（P＜0.01）。D＋d組 MAR、BFR/TV、BFR/BV、BFR/BS分 別 升 高 了 75.2%、416.1%、195.8%、174.8%（P＜0.01）。與 O＋D組比較，O＋D＋d組 MAR、BFR/TV、BFR/BV、BFR/BS分別升高了 62.6%（P＜0.01）、287.6%（P＜0.01）、217.1%（P＜0.05）、120.1%（P＜0.05），見(jiàn) Tab 4。

Fig 5 Fluorescent of bone formation in tibiaSgroup：A；D group：B；O group：C；O＋D group：D；O＋D＋d group：E；D＋d group：F；Thick slices with fluorescence photographs without staining（20×）

Tab 4 Dynam ic parameters of bone formation in tibia（±s，n＝10）

Tab 4 Dynam ic parameters of bone formation in tibia（±s，n＝10）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs Sgroup；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs D group；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 vs O＋Dgroup

Group MAR/μm·d-1 BFR/TV/%·yr-1 BFR/BV/%·yr-1 BFR/BS/%·yr-1 S 2.32±0.769 26.9±18.9 455±320 10.0±5.79 D 1.29±0.274* 6.20±5.32* 99.4±27.4* 2.54±0.867*O 0.621±0.553**＃ 1.17±1.17**＃ 29.5±29.1**＃＃ 0.593±0.590**＃＃O＋D 1.39±0.673* 5.65±3.07** 123±97.4* 3.64±2.93**O＋D＋d 2.26±0.553＃＃ΔΔ 21.9±8.27＃＃ΔΔ 390±269＃Δ 8.01±3.86＃＃Δ D＋d 2.26±0.633＃＃ 32.0±13.9＃＃ 294±104＃＃ 6.98±2.52＃＃

3 討論

3.1 小鼠去卵巢骨質(zhì)疏松模型的骨形態(tài)學(xué)特點(diǎn)與S組比較，O組骨小梁數(shù)量與面積明顯減少，結(jié)構(gòu)斷裂、稀疏，出現(xiàn)大片骨小梁缺失的骨髓區(qū)域，%Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N降低，Tb.Sp升高，說(shuō)明去卵巢致小鼠骨量丟失嚴(yán)重，骨小梁密度降低，分離度增加，呈現(xiàn)典型的骨質(zhì)疏松形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。破骨細(xì)胞較深地侵蝕骨表面，骨吸收參數(shù)升高，表明破骨細(xì)胞活性和數(shù)量增加，骨吸收功能活躍。成骨細(xì)胞在骨表面排列稀疏，呈扁平狀，分泌嗜酸性類(lèi)骨質(zhì)少，熒光少且弱，骨形成參數(shù)降低，表明成骨細(xì)胞數(shù)量少，功能不活躍、骨形成功能降低。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)去卵巢模型骨形成降低，骨吸收增加，符合低轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松，與張延?jì)傻龋?］研究發(fā)現(xiàn)不一致，這可能與實(shí)驗(yàn)周期有關(guān)，張延?jì)傻葘?shí)驗(yàn)周期為42 d，本實(shí)驗(yàn)周期為70 d，去卵巢屬于快速骨丟失，破骨細(xì)胞活性增加，骨吸收功能活躍，可能越到后期骨量丟失越多，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)O組骨量丟失嚴(yán)重，破骨細(xì)胞數(shù)量多、活性強(qiáng)，熒光標(biāo)記部分的骨表面被破骨細(xì)胞快速侵蝕，導(dǎo)致骨量明顯減少。這些結(jié)果提示，去卵巢初期成骨細(xì)胞的功能是活躍的，表現(xiàn)為高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松，隨著成骨細(xì)胞功能的衰退，后期則出現(xiàn)低轉(zhuǎn)換型的骨質(zhì)疏松，對(duì)此有待進(jìn)一步觀察。

去卵巢致骨質(zhì)疏松的發(fā)生是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過(guò)程，有多種刺激因素的作用和眾多調(diào)節(jié)因子參與了骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制，在這些因素的相互作用和共同影響下最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生，其中氧化應(yīng)激是絕經(jīng)期婦女骨質(zhì)疏松的一個(gè)重要發(fā)病機(jī)制［6］。近年來(lái)研究表明，去卵巢導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生的機(jī)制與OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)密切相關(guān)［7］。Wnt/β-catenin信號(hào)通路也參與了去卵巢致骨質(zhì)疏松的發(fā)生過(guò)程，通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的功能，從而間接調(diào)節(jié)骨形成［8］。

3.2 小鼠D-半乳糖骨質(zhì)疏松模型的骨形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及雌激素的影響 與S組比較，D組%Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N有減少的趨勢(shì)，Tb.Sp有增加的趨勢(shì)，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雖然從Fig 2-B1、B2中可以看出骨小梁結(jié)構(gòu)稀疏、變細(xì)、斷裂等變化，但并不能呈現(xiàn)出典型的骨質(zhì)疏松形態(tài)學(xué)改變。破骨細(xì)胞在骨表面開(kāi)始侵蝕骨小梁，骨吸收參數(shù)升高，表明破骨細(xì)胞數(shù)量和活性增加，骨吸收功能活躍。成骨細(xì)胞在骨表面排列稀疏，呈扁平狀，分泌嗜酸性類(lèi)骨質(zhì)較少，熒光少、暗淡，只見(jiàn)單熒光，骨形成參數(shù)降低，說(shuō)明成骨細(xì)胞功能不活躍，骨形成功能降低。綜上所述，D-半乳糖屬于低轉(zhuǎn)換型骨丟失，與羅紅梅等［9］研究發(fā)現(xiàn)一致。與O組比較，骨吸收參數(shù)降低，說(shuō)明D組骨吸收功能較O組弱，而骨形成參數(shù)升高，說(shuō)明D組比O組骨形成功能強(qiáng)。給予雌激素后，D＋d組骨小梁數(shù)量明顯增加，連續(xù)性較好，骨小梁分離度減少，破骨細(xì)胞數(shù)量減少，骨吸收活性降低，成骨細(xì)胞活性和骨形成功能增強(qiáng)，并降低該模型體重。

D-半乳糖是一種還原性單糖，在細(xì)胞醛糖還原酶的作用下，轉(zhuǎn)化為不能被機(jī)體進(jìn)一步代謝的半乳糖醇，堆積在細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、功能障礙、代謝紊亂，短時(shí)間內(nèi)引起機(jī)體衰老。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物長(zhǎng)期注射D-半乳糖會(huì)產(chǎn)生一系列與自然衰老相似的病理變化，有研究表明［10］男性骨質(zhì)疏松不僅與雄性激素減少有關(guān)，與衰老的發(fā)生過(guò)程也有關(guān)，是一種低轉(zhuǎn)換的骨丟失，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致，故D-半乳糖對(duì)研究老年性骨質(zhì)疏松可能有重要意義。雖然D-半乳糖對(duì)雌性小鼠骨量的影響存在不一致的結(jié)果，作者認(rèn)為該結(jié)果與劑量、給藥時(shí)間和年齡有關(guān)。羅紅梅等［3］D-半乳糖劑量為 600 mg·kg-1和 1200 mg·kg-1，給藥2個(gè)月，發(fā)現(xiàn)D-半乳糖提高♀小鼠骨礦程度。覃冬云等［11］D-半乳糖劑量為 1000 mg·kg-1，給藥42 d，發(fā)現(xiàn) D-半乳糖對(duì)3月齡♀小鼠發(fā)生骨質(zhì)丟失，而對(duì)1月齡♀小鼠無(wú)影響。本實(shí)驗(yàn)給藥劑量為120mg·kg-1，給藥時(shí)間70 d，發(fā)現(xiàn)♀小鼠脛骨上段骨吸收活躍，骨形成降低，如果適當(dāng)延長(zhǎng)給藥時(shí)間，應(yīng)該可以造成典型老年性骨質(zhì)疏松模型。有研究報(bào)道［9］，D-半乳糖致骨質(zhì)疏松機(jī)制可能與因腦老化導(dǎo)致腦-垂體-性腺功能紊亂有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究表明，雌激素對(duì)半乳糖致小鼠骨質(zhì)疏松具有預(yù)防作用，故D-半乳糖致骨質(zhì)疏松機(jī)制可能與引起體內(nèi)激素水平下降有關(guān)。

3.3 小鼠去卵巢加D-半乳糖骨質(zhì)疏松模型的特點(diǎn)及雌激素的影響 與S組比較，O＋D組骨小梁大量丟失，骨小梁間隙增大，%Tb.Ar、Tb.N、Tb.Th降低，Tb.Sp升高，說(shuō)明骨量丟失嚴(yán)重，骨微結(jié)構(gòu)破損，骨小梁厚度和數(shù)量降低，分離度增加。破骨細(xì)胞較深地侵蝕骨表面，骨吸收參數(shù)升高，表明破骨細(xì)胞數(shù)量增加，骨吸收功能活躍。成骨細(xì)胞在骨表面排列稀疏，呈扁平狀，其分泌嗜酸性類(lèi)骨質(zhì)少，熒光少且弱，骨形成參數(shù)降低，表明成骨細(xì)胞功能不活躍，骨形成降低。與O組比較，O＋D組骨吸收與骨形成參數(shù)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可知去卵巢后再給予D-半乳糖并不能加重骨質(zhì)疏松的進(jìn)程，其原因可能是小鼠去卵巢70 d后，兩組小鼠骨量已經(jīng)丟失很?chē)?yán)重，D組比O組骨吸收弱，而骨形成比去卵巢強(qiáng)，其骨量減少程度遠(yuǎn)不如去卵巢，故即使去卵巢聯(lián)合D-半乳糖也不能得到明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；蛘?0 d這不是最適合觀察時(shí)間點(diǎn)，因?yàn)檫@時(shí)兩組骨量都已經(jīng)嚴(yán)重丟失。與D組比較，O＋D組小鼠骨形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明兩組骨量變化無(wú)明顯差異。補(bǔ)充雌激素后，骨量、骨小梁厚度、數(shù)量增加，分離度降低，破骨細(xì)胞骨吸收功能降低，數(shù)量減少，成骨細(xì)胞活性增加，促進(jìn)骨形成，降低該模型體重。

去卵巢加D-半乳糖致小鼠骨質(zhì)疏松模型目前未見(jiàn)研究報(bào)道，本課題組為模擬正常婦女絕經(jīng)期與衰老同時(shí)發(fā)生的生理過(guò)程來(lái)更好地模擬骨質(zhì)疏松的發(fā)生過(guò)程，利用D-半乳糖所致衰老與去卵巢模擬絕經(jīng)期雌激素缺乏的基本原理來(lái)聯(lián)合制模。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)去卵巢合并D-半乳糖確實(shí)能明顯地減低小鼠脛骨上段骨量，可以作為一種新的骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)己烯雌酚能改善該模型的骨丟失。其抗骨質(zhì)疏松機(jī)制可能與以下幾點(diǎn)有關(guān)。（1）通過(guò)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的凋亡，抑制成骨細(xì)胞的凋亡［12］。（2）直接作用成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨形成［13］。（3）提高機(jī)體抗氧化能力［14］。

去卵巢、D-半乳糖、去卵巢聯(lián)合D-半乳糖均能建立小鼠骨質(zhì)疏松模型，相對(duì)去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松模型而言，D-半乳糖小鼠骨質(zhì)疏松模型骨形成活性較高，骨吸收活性較低，雌激素能有效預(yù)防D-半乳糖和去卵巢聯(lián)合D-半乳糖致小鼠骨質(zhì)疏松模型的骨丟失，可作為研究抗骨質(zhì)疏松藥物的陽(yáng)性對(duì)照藥。

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