張秀麗，閆巍巍，劉東志，張勵(lì)才

（1.徐州醫(yī)學(xué)院江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221002；2.嘉興市第二醫(yī)院麻醉科，浙江嘉興 314000）

炎性痛相關(guān)因素包括周圍組織損傷、缺血、缺氧、酸中毒，臨床治療炎性痛是醫(yī)生面對(duì)的一個(gè)難題。目前的研究主要集中在炎性痛與受體、離子通道、神經(jīng)遞質(zhì)的關(guān)系上。在炎性痛條件下，傷害性神經(jīng)遞質(zhì)，如組胺和5-羥色胺等的釋放增加，刺激了外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)傷害性感受器，從而提高神經(jīng)細(xì)胞的興奮性，增加背根神經(jīng)節(jié)、脊髓和腦組織痛相關(guān)物質(zhì)的表達(dá)［1-3］。ATP敏感性鉀離子通道廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)元，并調(diào)節(jié)其膜興奮性、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和參與神經(jīng)保護(hù)［4］。研究表明，側(cè)腦室內(nèi)注入KATP通道開放劑克羅卡林和吡那地爾可以增強(qiáng)皮下注射嗎啡引起的鎮(zhèn)痛作用，這種增強(qiáng)效應(yīng)可以被KATP通道特異性阻斷劑格列本脲消除，提示這種鎮(zhèn)痛作用的發(fā)揮與KATP通道有關(guān)［5］。DAMGO（一種μ阿片受體激動(dòng)劑）注入丘腦中央下核（thalamic nucleus submedius，Sm），減少脊髓背角c-Fos表達(dá)和抑制畏懼行為，而這種效應(yīng)可以被核團(tuán)內(nèi)預(yù)先注射格列本脲所阻斷［6］。這說(shuō)明KATP通道可能在脊髓上水平參與疼痛信號(hào)調(diào)控。越來(lái)越多的研究顯示，下丘腦室旁核參與疼痛調(diào)控。因此，本研究采用一種常用的動(dòng)物疼痛模型——CFA誘導(dǎo)的炎性痛模型，用免疫組織化學(xué)的方法觀察炎性痛條件下下丘腦室旁核神經(jīng)元中KATP通道的表達(dá)變化和傷害性行為相關(guān)的脊髓背角c-Fos的表達(dá)，為進(jìn)一步理解炎性痛的發(fā)病機(jī)制及探討KATP通道在炎性痛中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑及器材 兔抗 kir6.2一抗（1∶200，Alomone Labs，以色列）；c-Fos一抗（1∶400，Abcam，美國(guó)）；FITC標(biāo)記的驢抗兔（1∶200，Millipore公司，美國(guó)）；組化試劑盒（北京中杉）；二氮嗪（Sigma，美國(guó)）；激光共聚焦顯微鏡（FV1000，Olympus，日本）；熱痛敏刺激儀（IITC series 8-390型，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所生產(chǎn)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley大鼠，♂，250～280 g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)在12 h/12 h明暗光線交替、22～24℃的安靜環(huán)境中，自由進(jìn)食、水。所有實(shí)驗(yàn)均遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用規(guī)范》。采用隨機(jī)數(shù)字法分為5組（每組6只）：正常組（Normal組）、完全弗氏佐劑致炎性痛組（CFA組）、生理鹽水對(duì)照組（Saline組）、KATP通道特異性激動(dòng)劑二氮嗪組（Diaoxide組）和激動(dòng)劑溶媒對(duì)照組（Vehicle組）。

1.3 模型的建立 將大鼠輕輕固定，用100μl微量注射器，盡快將用生理鹽水稀釋后的100μl濃度為50%的完全弗氏佐劑（CFA）注入大鼠左側(cè)后肢足底中心皮下，建立慢性炎性痛模型。對(duì)照組僅足底皮下注射生理鹽水100μl。CFA足底注射后大鼠產(chǎn)生典型的外周炎癥表現(xiàn)，包括：注射局部的紅、腫、疼痛等，持續(xù)時(shí)間大于1周。

1.4 下丘腦室旁核核團(tuán)注射 在致炎后d 3，大鼠直接以水合氯醛麻醉（300 mg·kg-1體重，ip），參照《大鼠腦立體坐標(biāo)圖譜》（Paxinos and Watson），于立體定位儀（日本）上向大鼠一側(cè)側(cè)腦室［前囟：（-1.6～1.8）mm；深：（7.8-8.0）mm；中縫向左右旁開（0.3-0.6）mm］注射二氮嗪（diaoxide）25ng（溶于0.3μl 0.5%DMSO中）。注射后15、30、60、240 min后檢測(cè)熱痛閾。

1.5 熱縮足反射潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL） 在相同的時(shí)間段、相同的室內(nèi)溫度和濕度下進(jìn)行測(cè)定。按照Hargreaves法，將大鼠放置于3 mm厚的15 cm×15 cm×15 cm的有機(jī)玻璃箱中，待大鼠在其中適應(yīng)30 min安靜后，用熱痛敏刺激儀照射大鼠左后肢足底后外側(cè)。從照射開始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避的時(shí)間為TWL。光源刺激強(qiáng)度恒定不變。自動(dòng)切斷時(shí)間為25 s，以防止組織損傷。每只動(dòng)物連續(xù)測(cè)定5次，測(cè)量間隔3 min，取后3次比較平穩(wěn)的數(shù)據(jù)平均值為大鼠TWL。

1.6 組織制備 大鼠用10%水合氯醛（300 mg·kg-1）腹腔注射麻醉后，經(jīng)左心室-升主動(dòng)脈插管，依次灌注37℃生理鹽水150 ml沖洗和4℃、4%多聚甲醛溶液300 ml固定，總灌注時(shí)間為1～1.5 h。取大腦組織和脊髓后，放入4%多聚甲醛溶液中4℃后固定過(guò)夜；轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液中4℃脫水至組織沉淀。冰凍連續(xù)冠狀切片，熒光片厚40μm，取相應(yīng)腦組織節(jié)段的切片；取腰脊髓L4-5節(jié)段切片，片厚 30μm。用 0.01 mol·L-1PBS（NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，NaH2PO40.24 g，Na2HPO43.63 g；pH 7.4）沖洗切片3次×5 min/次。

1.7 免疫熒光單標(biāo) 選取完整切片至24孔孵育板中，加入含0.3%Triton-100的10%驢血清封閉液，室溫封閉2h；加入兔抗kir6.2一抗（1∶200）或兔抗c-Fos一抗（1∶400），4℃孵育 48 h；0.01 mol·L-1的PBS沖洗3次×5 min/次；暗室中加入FITC標(biāo)記的驢抗兔（1∶200），4℃孵育過(guò)夜，0.01 mol·L-1的PBS沖洗3次×5 min/次，貼片、室溫干片、50%甘油封片，激光共聚焦顯微鏡避光下放大100倍、400倍，對(duì)腦和脊髓組織切片進(jìn)行觀察并攝片。免疫對(duì)照組用PBS代替一抗，其余步驟同前。

1.8 顯微圖像和細(xì)胞計(jì)數(shù) 免疫熒光染色切片采用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀測(cè)。光鏡切片細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：各例動(dòng)物取相同層面KATP陽(yáng)性細(xì)胞最集中的4張腦和脊髓組織切片，于100倍放大，在固定部位截取一屏（脊髓組織取脊髓背角Ⅰ、Ⅱ板層恒定位置）分別計(jì)數(shù)KATP陽(yáng)性和c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有計(jì)量資料均用ˉx±s表示，采用SPSS13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并生成統(tǒng)計(jì)圖表。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)；兩組比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 炎性痛行為學(xué)改變和脊髓c-Fos在炎性痛條件下的表達(dá)變化 CFA組和Saline組之間，術(shù)前TWL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。左側(cè)足底皮下注射CFA致炎后d 1、d 3、d 7，TWL明顯降低，低于術(shù)前的基礎(chǔ)值（P＜0.01）；與Saline組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)伴有患足紅腫、行走困難及提縮患爪等一些保護(hù)性行為，而且這一效果持續(xù)至少3 d，然后才逐漸減輕。Saline組大鼠術(shù)前和術(shù)后的TWL未見(jiàn)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CFA致炎后 d 3、d 7，腰段脊髓背角的c-Fos表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn) Fig 1、2。

Fig 1 Timecourse of development of thermal hypersensitivity in rats after intraplantar injection with CFA or saline±s，n＝6，unit：second）**P＜0.01 vs saline group；＃＃P＜0.01 vs day 0

2.2 下丘腦室旁核KATP陽(yáng)性神經(jīng)元 CFA組和生理鹽水組均可見(jiàn)KATP陽(yáng)性細(xì)胞。CFA致炎后d 3和d 7，大鼠腦片中計(jì)數(shù)到的KATP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯小于Saline組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)Fig 3。

2.3 PVN內(nèi)注射KATP通道特異性激動(dòng)劑后大鼠痛行為學(xué)及脊髓背角c-Fos表達(dá)變化 外周致炎后d 3，室旁核給予特異性免疫激動(dòng)劑后，Diaoxide組大鼠的TWL明顯升高，高于給藥前的TWL，與Vehicle組相比也增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；這一效應(yīng)在給藥后10～15 min達(dá)到最大，到4 h衰減到給藥前水平。Vehicle組的TWL在給藥后各時(shí)間點(diǎn)與給藥前比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。給予激動(dòng)劑后腰脊髓c-Fos表達(dá)較給藥前和Vehicle組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)Fig 4，5。

Fig 2 c-Fos-expression in dorsal spinal horn of saline group，CFA 3d and CFA 7d and numbers of c-Fos positive neurons in dorsal spinal horn of normal，CFA 3d and CFA 7d（ˉx±s，n＝6）Graphs A，C，E representexpression of c-Fos in saline group，CFA 3d and CFA 7d.Graphs B，D，F(xiàn)are the enlargementof graphs A，C，E.**P＜0.01 vs saline group；＃＃P＜0.01 vs CFA 3d.Scale bars：100μm.

Fig 3 KATP-expression in paraventricular nucleus of saline group，CFA 3d and CFA 7d.3V：the 3rd ventricle and numbers of KATP positive neurons in PVN of saline group，CFA 3d and CFA 7d（ˉx±s，n＝6）Graphs A，C，E representexpression of KATP in saline group，CFA 3d and CFA 7d.Graphs B，D，F(xiàn) are the enlargementof graphs A，C，E.**P＜0.01 vs saline group；＃＃P＜0.01 vs CFA 3d.Scale bars：100μm.

Fig 4 Effect of injection of diaoxide on TW L after CFA injection（±s，n＝6，unit：second）*P＜0.05，**P＜0.01 vs vehicle group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs0min.

3 討論

ATP敏感性鉀離子通道是一種受神經(jīng)遞質(zhì)或細(xì)胞內(nèi)ATP調(diào)控的內(nèi)向整流鉀通道，ATP濃度升高時(shí)其開放率明顯下降?，F(xiàn)有的研究顯示，KATP通道存在于大鼠的中樞神經(jīng)元及脊髓背角神經(jīng)元上［7-8］，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，可能與疼痛調(diào)控的相關(guān)機(jī)制有關(guān)。Wu等［8］研究發(fā)現(xiàn)坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷（chronic constriction injury of the sciatic nerve，CCI）術(shù)后，在神經(jīng)損傷的同側(cè)可發(fā)現(xiàn)脊髓背角KATP亞基表達(dá)均下調(diào)，伴隨著熱痛和機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏；足底局部注射KATP通道激動(dòng)劑磺脲類藥物能拮抗足底注射低劑量雙氯芬酸對(duì)福爾馬林致炎性痛的治療效應(yīng)［9］。這些研究都說(shuō)明KATP通道參與了疼痛的發(fā)生過(guò)程。

本實(shí)驗(yàn)采用了一種常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，CFA誘導(dǎo)的炎性痛。該模型能成功模擬病理性疼痛典型的自發(fā)痛、痛覺(jué)過(guò)敏和觸誘發(fā)痛等癥狀，并維持一段時(shí)間，結(jié)果證實(shí)，大鼠CFA致炎后d 1 TWL即降低，直到d 3都維持在較低水平［10］。

研究表明，生理性刺激大鼠初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元能引起脊髓背角突觸后神經(jīng)元的c-Fos表達(dá)，傷害性熱刺激也能升高脊髓背角Ⅰ、Ⅱ板層c-Fos的表達(dá)，而嗎啡預(yù)處理可以減少上述c-Fos的表達(dá)。這從另一方面說(shuō)明藥物對(duì)疼痛的治療作用也可以通過(guò)免疫組化標(biāo)記c-Fos來(lái)反映［11］。c-Fos表達(dá)可作為傷害性刺激后疼痛傳導(dǎo)和調(diào)控的標(biāo)志，c-Fos表達(dá)與疼痛狀態(tài)相對(duì)應(yīng)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，免疫組化顯示，CFA注射同側(cè)的脊髓背角有c-Fos表達(dá)且主要表達(dá)在與疼痛相關(guān)的L4-5脊髓Ⅰ、Ⅱ板層，這些結(jié)果和上述關(guān)于c-Fos的相關(guān)研究一致；注射CFA后c-Fos表達(dá)增加，d 3表達(dá)最高，這和疼痛行為學(xué)結(jié)果一致，從形態(tài)學(xué)上證明CFA炎性痛模型的成功。

研究結(jié)果表明，疼痛模型下，疼痛信號(hào)相關(guān)解剖結(jié)構(gòu)的KATP通道蛋白表達(dá)下降；本實(shí)驗(yàn)免疫熒光結(jié)果顯示，在炎性痛條件下，下丘腦室旁核KATP通道表達(dá)下降，d 3下降最明顯，這與疼痛行為學(xué)變化是一致的。這說(shuō)明室旁核KATP通道可能參與炎性痛的發(fā)生過(guò)程。疼痛最明顯的d 3，室旁核注射KATP通道特異性激動(dòng)劑二氮嗪能逆轉(zhuǎn)CFA致炎引起的熱痛敏，同時(shí)可減輕疼痛誘發(fā)的脊髓背角c-Fos的表達(dá)，進(jìn)一步為室旁核KATP通道參與炎性痛的調(diào)控提供證據(jù)。

在脊髓水平，去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）通過(guò)激活中間神經(jīng)元的內(nèi)源性阿片受體，阿片受體進(jìn)一步激活KATP通道，從而產(chǎn)生抗傷害性刺激的作用［12］。實(shí)驗(yàn)表明，電刺激引起的疼痛模型下，下丘腦內(nèi)源性相關(guān)肽（甲硫氨酸腦啡肽、β內(nèi)啡肽）水平增加［13］，而研究證實(shí)大鼠下丘腦室旁核NE在疼痛的調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用［14］，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，我們推測(cè)下丘腦室旁核KATP通道可能是通過(guò)NE激活室旁核的內(nèi)源性阿片肽受體，從而進(jìn)一步激活KATP通道，參與炎性痛發(fā)生和調(diào)控的過(guò)程。

綜上所述，通過(guò)對(duì)下丘腦室旁核KATP通道表達(dá)與炎性痛引起的機(jī)械痛和熱痛敏之間的關(guān)系的研究，我們推測(cè)下丘腦室旁核KATP通道可能參與疼痛的發(fā)生和調(diào)控過(guò)程，為炎性痛的發(fā)生機(jī)制及治療提供新的線索，為臨床治療炎性痛提供新的參考。

Fig 5 C-Fos-expression in dorsal spinal horn of CFA 3d，vehicle and diaoxide groups and numbers of c-Fos positive neurons in dorsal spinal horn of CFA 3d，vehicle and diaoxide groups（±s，n＝6）Graphs A，C，E represent expression of c-Fos in CFA 3d，vehicle and diaoxide groups.Graphs B，D，F(xiàn) are the enlargement of graphs A，C，E.**P＜0.01 vs CFA 3d；＃＃P＜0.01 vs vehicle group.Scale bars：100μm

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