蘇 瑋，朱龍軍，許大平，崔 巍，3，張在軍，3，胡勝全，3，麥成雄，3，韓怡凡，3

（1.香港理工大學(xué)應(yīng)用生物與化學(xué)技術(shù)學(xué)系，香港；2.暨南大學(xué)新藥研究所，廣東廣州 510632；3.香港理工大學(xué)深圳研究院，廣東深圳 518057）

阿爾采末病（Alzheimer’s disease，AD）是由腦病變損害導(dǎo)致患者記憶、思維和行為障礙的慢性神經(jīng)退行性疾病。大多數(shù)AD患者的年齡超過65歲。據(jù)統(tǒng)計AD患病率約占老年人10%，85歲以上人群的發(fā)病率更接近50%。隨著人口的持續(xù)老齡化，AD已成為繼心腦血管疾病、惡性腫瘤之后的第三大殺手。現(xiàn)今全世界AD患病人數(shù)超過2 500萬，我國估計已達700萬［1］。美國每年用于AD患者的護理和藥費支出高達1100億美元，超過了心腦血管疾病和惡性腫瘤 。因此，AD已成當代社會和家庭的沉重負擔(dān)，它不僅是一個重大的醫(yī)學(xué)問題，更是一個社會問題。

AD典型病理特征是老年斑（senile plaques）、神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles）以及與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的皮層神經(jīng)細胞進行性凋亡。雖然AD發(fā)生、發(fā)展的分子機制尚不明了，但學(xué)界普遍認可AD是多因素、多環(huán)節(jié)機制介導(dǎo)的復(fù)雜疾病，并提出膽堿能學(xué)說、β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）毒性學(xué)說、神經(jīng)興奮性毒性學(xué)說、細胞凋亡學(xué)說、自由基損傷學(xué)說等多種學(xué)說，從不同角度闡述AD的分子機制和病理變化。這些學(xué)說對深入理解AD發(fā)病機制和開發(fā)有效防治藥物有重要指導(dǎo)意義［2］。

Aβ毒性學(xué)說在眾多學(xué)說中尤其受到關(guān)注。AD相關(guān)遺傳、環(huán)境因素可誘導(dǎo)β-淀粉樣前體蛋白（APP）過度表達，提高β-和γ-分泌酶活性，降低α-分泌酶的活性，促進Aβ分泌。Aβ存在單體、寡聚體、纖維等不同聚集形式。其中，可溶性Aβ寡聚體具有極高神經(jīng)毒性，可抑制長時程增強（long-term potentiation，LTP）形成、并誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡。AD患者腦中可溶性Aβ寡聚體濃度與認知能力降低呈因果相關(guān)［3］。這些證據(jù)提示可溶性Aβ寡聚體是AD的主要致病分子，立足于對抗Aβ神經(jīng)毒性的“對因治療”方案是突破AD治療瓶頸的關(guān)鍵。

臨床治療AD嚴重依賴“一藥一靶位”（one-drug-singletarget）的乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）抑制劑和 N-甲 基-D-天 冬 氨 酸 （N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）受體拮抗劑。但“一藥一靶位”藥物治療AD在本質(zhì)上存在不足。AD發(fā)病與多基因、多環(huán)節(jié)相關(guān)，“一藥一靶位”藥物僅能緩解AD病癥，無法產(chǎn)生“對因治療”效果。此外，許多AD靶標具有生理功能，過分抑制容易導(dǎo)致副作用。臨床數(shù)據(jù)也顯示，“一藥一靶位”藥物療效非常有限，僅能改善部分AD患者癥狀。

“一藥多靶位”（one-drug-multiple-target）藥物可能是防治AD最有前途的方向。首先，Aβ、AChE、NMDA受體、神經(jīng)元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）等已被證實是防治AD的重要靶標。其次，部分AChE抑制劑也被發(fā)現(xiàn)能同時作用多個靶位。此外，“一藥多靶位”藥物在臨床治療學(xué)上也有明顯優(yōu)勢，能克服聯(lián)合用藥的缺陷，提高AD患者的順應(yīng)性。

近10余年，本研究小組致力“一藥多靶位”防治AD藥物的研究，并成功研制了一系列包含他克林（tacrine，Cognex?）和石杉堿甲（huperzine A）片段的新型高活性抗AD雙聯(lián)體（Fig 1）［4］。這些雙聯(lián)體合成步驟簡單，成本低廉，且已在眾多AD細胞、動物模型展示了優(yōu)于臨床AD藥物的療效，精巧地體現(xiàn)了中西藥物的最優(yōu)化組合，展示了傳統(tǒng)中藥現(xiàn)代化進程中的嶄新趨勢。本文綜述其中具代表性的新型益腦雙聯(lián)體（Bis（n）-Cognitin，又稱 Bis（n）-tacrine）防治 AD的藥理作用及其分子機制的研究進展。

1 Bis（n）-Cognitin同時結(jié)合AChE兩個活性中心、選擇性抑制AChE

Sussman等［5］應(yīng)用X射線-單晶衍射技術(shù)解析了AChE的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)AChE具有催化陰離子位點（catalytic anionic site）和外周陰離子位點（peripheral anionic site，）兩個活性中心，分別發(fā)揮催化乙酰膽堿（acetylcholine）水解和調(diào)節(jié)酶活性的作用。他克林是臨床用于AD治療的AChE抑制劑。Pang等［6］應(yīng)用計算機輔助分子對接技術(shù)發(fā)現(xiàn)他克林能結(jié)合AChE的兩個活性中心，因此提出通過橋聯(lián)基團將雙分子他克林鏈接，以期獲得能同時結(jié)合AChE兩個活性中心、具有更高抑制活性的Bis（n）-Cognitin（Fig 2）。另一方面，由于丁酰膽堿酯酶（butyrylcholinesterase，BuChE）不具備外周陰離子位點，因此，Bis（n）-Cognitin有望選擇性抑制AChE。

Fig 2 Structure-based rational drug design for Bis（n）-Cognitin（adapted from Pang et al.［6］）

Pang等［6］合成了不同鏈長的 Bis（n）-Cognitin，并測試其體外AChE抑制活性和選擇性，結(jié)果顯示：Bis（n）-Cognitin可明顯抑制AChE，其中Bis（7）-Cognitin（7個亞甲基連接的雙聯(lián)體）的活性最高，其半抑制濃度（IC50）達到1.6 nmol·L-1。與他克林相比，Bis（7）-Cognitin的AChE抑制活性強了1 000倍，選擇性強了10 000倍。酶動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：Bis（7）-Cognitin對AChE抑制模式為混合型，表觀動力學(xué)常數(shù)（Ki）為 1.4～2.8 nmol·L-1，證實了 Bis（n）-Cognitin通過同時結(jié)合催化位點和外周位點抑制AChE。Yu等［7］測試了Bis（n）-Cognitin在體AChE抑制活性，結(jié)果顯示：口服或腹腔注射Bis（7）-Cognitin均能明顯抑制大鼠腦內(nèi)AChE，且抑制活性和選擇性均高于他克林。這些研究結(jié)果證實Bis（n）-Cognitin能同時結(jié)合 AChE兩個活性中心，選擇性抑制AChE。

2 Bis（n）-Cognitin多靶點抑制Aβ神經(jīng)毒性

Aβ構(gòu)成的老年斑是AD的主要病理特征，可溶性Aβ寡聚體是AD的主要致病分子。對抗Aβ神經(jīng)毒性是“對因治療”AD的主要目標。Fu等［8］應(yīng)用轉(zhuǎn)染APP的N2a細胞模型，發(fā)現(xiàn)Bis（7）-Cognitin可阻止細胞分泌Aβ，進一步研究發(fā)現(xiàn)，Bis（7）-Cognitin是通過激活蛋白激酶 C（protein kinase C）、增強α-分泌酶活性實現(xiàn)上述作用的。Fu等［8］還發(fā)現(xiàn)Bis（7）-Cognitin可直接抑制重組人源β-分泌酶，其半抑制濃度為7.5μmol·L-1，提示 Bis（7）-Cognitin可能通過同時抑制β-分泌酶、提高α-分泌酶活性，阻止 Aβ分泌。此外，F(xiàn)u等［9］發(fā)現(xiàn) Bis（7）-Cognitin可預(yù)防 Aβ25-35纖維、Aβ1-42纖維以及可溶性Aβ1-42寡聚體誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞凋亡。進一步研究表明：Bis（7）-Cognitin是通過拮抗L-型鈣離子通道對抗Aβ神經(jīng)毒性的。另外，本研究小組初步研究還發(fā)現(xiàn)Bis（7）-Cognitin能提高高頻電刺激誘發(fā)的LTP、逆轉(zhuǎn)可溶性Aβ寡聚體誘導(dǎo)的LTP抑制。這些研究證實Bis（n）-Cognitin能多靶點抑制Aβ神經(jīng)毒性，提示Bis（n）-Cognitin可能“對因治療”AD。

3 Bis（n）-Cognitin通過同時抑制NMDA受體及nNOS阻斷神經(jīng)興奮性毒性

谷氨酸（glutamate）誘導(dǎo)的神經(jīng)興奮性毒性是AD中神經(jīng)細胞死亡的“最后通路”。阻斷神經(jīng)興奮性毒性是治療AD的重要手段。Li等［10］發(fā)現(xiàn) Bis（7）-Cognitin可在大鼠小腦顆粒神經(jīng)細胞預(yù)防谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)興奮性毒性。Luo等［11］應(yīng)用同一模型發(fā)現(xiàn)，Bis（3）-Cognitin也有類似的神經(jīng)保護作用。進一步電生理學(xué)研究顯示：Bis（7）-Cognitin和Bis（3）-Cognitin可抑制NMDA誘發(fā)電流，其半抑制濃度分別為0.19和0.52μmol·L-1，效價分別是美金剛的9倍和3倍，證實Bis（n）-Cognitin是NMDA受體拮抗劑，可通過拮抗NMDA受體對抗神經(jīng)興奮性毒性。此外，Luo等［11］發(fā)現(xiàn)Bis（n）-Cognitin拮抗NMDA受體具有電壓依賴、反競爭、快速解離等特性，可特異抑制病理條件下激活的NMDA受體，而對NMDA正常功能幾無影響，提示Bis（n）-Cognitin臨床副作用可能較小。

nNOS是神經(jīng)興奮性毒性的重要中介分子，NMDA受體興奮后活化nNOS，產(chǎn)生一氧化氮（NO），促進神經(jīng)細胞凋亡。Li等［12］應(yīng)用谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)興奮性毒性模型，發(fā)現(xiàn)Bis（7）-Cognitin能降低細胞內(nèi)NO水平。體外放射性酶活實驗顯示：Bis（7）-Cognitin可競爭性抑制重組人源 nNOS，其半抑制濃度為2.9μmol·L-1，提示 Bis（7）-Cognitin可能通過同時抑制NMDA受體、nNOS，對抗神經(jīng)興奮性毒性。這些研究證實，Bis（n）-Cognitin是“一藥多靶位”化合物，可能多靶點阻止神經(jīng)興奮性毒性。

Fig 1 Chem ical structures of Bis（n）-Cognitin，Tacrine（n）-hupyridone and Bis（n）-hupyridone

4 Bis（n）-Cognitin對抗氧化應(yīng)激和線粒體損傷

氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙在AD發(fā)生、發(fā)展中有重要影響。Xiao等［13］研究發(fā)現(xiàn)，Bis（7）-Cognitin對 H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞氧化應(yīng)激損傷有明顯保護作用。H2O2可明顯降低細胞存活率、減少谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase）和過氧化氫酶（catalase）活性、增加細胞內(nèi)丙二醛（malondialdehyde）積累，而Bis（7）-Cognitin預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)上述變化。此外，F(xiàn)u等［14］通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)：Bis（7）-Cognitin可增加抗增殖蛋白（prohibitin）、電壓敏感性陰離子通道蛋白 1（voltage-dependent anion channel 1 protein）、熱休克蛋白90（heat shock protein 90）、14-3-3β蛋白在線粒體的表達，挽救谷氨酸誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降，證明Bis（n）-Cognitin有抗線粒體損傷作用，可能用于AD治療。

5 Bis（n）-Cognitin調(diào)控信號通路預(yù)防細胞凋亡

AD神經(jīng)細胞凋亡機制復(fù)雜，涉及磷脂酰肌醇-3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3-K）/蛋白激酶 B（Akt）、細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK）、p38等眾多信號通路［15］。Hu等［16］發(fā)現(xiàn) Bis（3）-Cognitin在大鼠小腦顆粒神經(jīng)細胞可預(yù)防撤鉀誘導(dǎo)的細胞凋亡，其機制與Bis（3）-Cognitin激活血管內(nèi)皮生長因子受體-2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）及下游 PI3-K/Akt信號通路有關(guān)。Yao等［17］發(fā)現(xiàn) Bis（3）-Cognitin激活PI3-K/Akt信號通路后可提高下游肌細胞增強因子-2D（myocyte enhancer factor-2D，MEF2D）的轉(zhuǎn)錄活性，預(yù)防1-甲基-4-苯基吡啶（MPP＋）以及 α-突觸核蛋白（α-synuclein）誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)細胞凋亡。此外，Li等［10］發(fā)現(xiàn)Bis（7）-Cognitin可通過同時抑制 ERK、p38信號通路，預(yù)防谷氨酸誘導(dǎo)的大鼠小腦顆粒神經(jīng)細胞凋亡。Hu等［18］發(fā)現(xiàn)Bis（3）-Cognitin可通過激活 PI3-K/Akt、抑制 ERK信號通路，對抗神經(jīng)興奮性毒性。這些研究證實Bis（n）-Cognitin可通過調(diào)控信號通路，阻止細胞凋亡，提示Bis（n）-Cognitin可能預(yù)防AD等神經(jīng)退行性疾病。

6 Bis（n）-Cognitin拮抗離子通道型受體緩解AD癥狀

AD病程中，患者腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)會發(fā)生改變。因此，可望通過綜合調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)緩解AD癥狀，改善患者情緒、認知。Li等［19］發(fā)現(xiàn) Bis（n）-Cognitin可抑制 γ-氨基丁酸（γaminobutyric acid，GABA）誘發(fā)電流。其中，Bis（2）-Cognitin的半抑制濃度為0.48μmol·L-1，效價是荷包牡丹堿的11倍，證明 Bis（n）-Cognitin是極強的 γ-氨基丁酸 A受體（GABAAreceptor）拮抗劑。Ros等［20］等發(fā)現(xiàn) Bis（7）-Cognitin可抑制乙酰膽堿誘發(fā)電流，其半抑制濃度為0.16μmol·L-1，顯示 Bis（n）-Cognitin對煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptor）也有拮抗作用。此外，Luo等［21］發(fā)現(xiàn)Bis（7）-Cognitin還可抑制 5-羥色胺（5-hydroxytryptamine）誘發(fā)電流，其半抑制濃度為 2.0μmol·L-1，表明 Bis（n）-Cognitin是5-羥色胺3型離子通道受體（5-HT3receptor）拮抗劑。以上研究證實，Bis（n）-Cognitin是優(yōu)秀的“一藥多靶標”化合物，能夠拮抗多種離子通道型受體，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，可望在“對因治療”AD的同時緩解AD癥狀。

7 Bis（n）-Cognitin明顯改善動物學(xué)習(xí)記憶能力

AD患者的學(xué)習(xí)記憶能力進行性衰退，治療AD的首要任務(wù)是恢復(fù)患者學(xué)習(xí)記憶能力。Wang等［22］通過東茛菪堿致大鼠癡呆模型，發(fā)現(xiàn)腹腔注射Bis（7）-Cognitin能明顯縮短動物在Morris水迷宮實驗的尋臺潛伏期，其效價是他克林的12倍。Pan等［23］應(yīng)用同一模型，發(fā)現(xiàn)腹腔注射 Bis（7）-Cognitin能減少動物避暗實驗的錯誤次數(shù)，其效價是他克林的5倍。Han等［24］發(fā)現(xiàn)腹腔注射 Bis（3）-Cognitin和 Bis（7）-Cognitin均可明顯提高腹腔注射東茛菪堿小鼠的新物體認知能力和空間記憶能力，其效價分別是他克林的5倍和20倍。另外，Liu等［25］通過腦室注射膽堿能神經(jīng)毒素AF64A的大鼠模型，發(fā)現(xiàn)腹腔注射Bis（7）-Cognitin對動物空間認知能力下降有明顯改善作用。這些結(jié)果均證實Bis（n）-Cognitin能明顯改善動物學(xué)習(xí)記憶能力損傷，可用于AD治療。

8 Bis（n）-Cognitin在多種動物模型阻止神經(jīng)細胞凋亡

在體阻止神經(jīng)細胞凋亡是治療神經(jīng)退行性疾病的主要途徑［26］。Zhao等［27］研究發(fā)現(xiàn)：Bis（7）-Cognitin和 Bis（3）-Cognitin可明顯降低大鼠大腦中動脈缺血/再灌注誘導(dǎo)的梗死灶面積。Shu等［28］在老齡大鼠雙側(cè)頸總動脈永久結(jié)扎模型中發(fā)現(xiàn)，Bis（7）-Cognitin能改善缺血引起的動物認知能力損傷，其機制與海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞凋亡減少有關(guān)。Li等［29］通過大鼠視網(wǎng)膜缺血/再灌注模型研究發(fā)現(xiàn) Bis（7）-Cognitin可對抗缺血引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡。最近，Yao等［17］還發(fā)現(xiàn) Bis（3）-Cognitin能保護小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)細胞，對抗 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）引起的動物行為能力損傷。以上研究結(jié)果均顯示Bis（n）-Cognitin具有極強的神經(jīng)保護活性，不僅可能“對因治療”AD，還能有助于血管性癡呆、帕金森病、青光眼等神經(jīng)退行性疾病的治療。

9 小結(jié)與展望

綜上所述，Bis（n）-Cognitin可同時作用 AChE、β-分泌酶、NMDA受體、nNOS等多個AD重要靶標，抑制Aβ神經(jīng)毒性、阻斷神經(jīng)興奮性毒性、降低氧化應(yīng)激和線粒體損傷。此外，Bis（n）-Cognitin還能阻止神經(jīng)細胞凋亡、改善動物認知障礙。作為優(yōu)秀的“一藥多靶位”化合物，Bis（n）-Cognitin極有可能成為未來防治AD，甚至其他神經(jīng)退行性疾病的高效藥物。

但要將Bis（n）-Cognitin開發(fā)成藥，研究還需考慮多方面問題。如AD動物模型不能完全模擬人類AD發(fā)病全部特征，因此需要驗證Bis（n）-Cognitin在多個AD動物模型，尤其是轉(zhuǎn)基因小鼠的療效。另外，Bis（n）-Cognitin的安全性及臨床療效也需進一步研究。

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