李新娟，魏林郁，李超堃，盧 娜，王國紅，趙紅崗，李東亮

（河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室，河南新鄉(xiāng) 453003）

缺血性腦血管疾病以其高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率而嚴(yán)重危害人類健康，目前對其尚無完全有效的治療手段。近年來的研究表明，硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是繼NO和CO之后發(fā)現(xiàn)的第3種具有生物活性的內(nèi)源性氣體信號分子，H2S不借助任何特殊的運輸工具就能快速通過細(xì)胞膜，對一系列生物靶點產(chǎn)生影響。越來越多的證據(jù)表明，H2S對多種組織的在體或離體缺血/再灌注損傷模型具有細(xì)胞保護作用［1-3］。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，H2S供體化合物硫氫化鈉（sodium hydrosulfide，NaHS）對腦缺血/再灌注引起的神經(jīng)元損傷有保護作用［4］，但其保護機制尚不完全清楚。另有研究表明，P2X7受體在腦缺血損傷的病理生理過程中扮演著重要的角色［5］，而目前關(guān)于H2S對缺血/再灌注腦組織中P2X7受體表達的影響國內(nèi)外尚未見報道，本實驗通過制備大鼠大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，觀察H2S對局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠腦組織中P2X7受體蛋白表達的影響，探討H2S對缺血/再灌注損傷腦保護作用的可能機制，為更好地預(yù)防與治療缺血性腦血管疾病提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 NaHS購自Sigma公司。2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）購自北京生化制藥廠。兔抗鼠P2X7多克隆抗體（sc-25698）購自 Santa Cruz。Cy3標(biāo)記羊抗兔IgG、DAPI、抗熒光淬滅封片液均購自碧云天生物技術(shù)研究所。MCAO栓線購自北京沙東生物技術(shù)有限公司。

1.2 動物分組與給藥方法 Sprague-Dawley（SD）大鼠♂，合格證號：SCXK（豫）2010-0002，體質(zhì)量200～240 g，隨機分為3組：假手術(shù)組、腦缺血/再灌注（I/R）組、NaHS＋I/R組，如有動物死亡，隨機選取大鼠補足每組16只。NaHS＋I/R組于插入栓線后10 min按25μmol·kg-1的劑量腹腔注射現(xiàn)配置的NaHS生理鹽水溶液，假手術(shù)組和I/R組在相同時間點腹腔注射等容積生理鹽水。

1.3 動物模型的制備［6-7］參照Longa等方法，略做改進制備大鼠左側(cè)大腦中動脈栓塞模型。100 g·L-1水合氯醛（350 mg·kg-1，ip）麻醉動物，頸部備皮，正中剪開皮膚，鈍性分離腺體和筋膜，依次分離左側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈。在頸內(nèi)和頸外動脈分叉處結(jié)扎頸外動脈，同時結(jié)扎頸總動脈，動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈遠(yuǎn)心端，在頸總動脈結(jié)扎線上方穿線打松結(jié)備用，頸總動脈結(jié)扎線上方斜剪一小口，將AA級2432的栓線由此插入動脈，將栓線慢慢插入頸內(nèi)動脈，去除動脈夾，當(dāng)栓線進入距頸內(nèi)和頸外動脈分叉處約18～19 mm有阻擋感時停止插入栓線，用頸總動脈上穿的備用線固定栓線，縫合皮膚。將動物放回籠中，置于室溫26℃的室內(nèi)。缺血2 h，乙醚吸入麻醉動物后，將栓線輕輕拔至有阻力時提示栓線頭端已至頸總動脈切口處。假手術(shù)組僅分離動脈。

1.4 大鼠死亡率計算、神經(jīng)功能缺陷評分［7］統(tǒng)計各組大鼠的死亡情況，死亡率以各組死亡大鼠數(shù)量/各組樣本量×100%計算；大鼠腦缺血2 h，再灌注24 h，參照Longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)，對實驗大鼠進行神經(jīng)功能行為評分，0分：無神經(jīng)功能缺失癥狀；1分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺失（不能完全伸展對側(cè)前肢）；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺失（向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈）；3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺失（向?qū)?cè)傾倒）；4分：不能自發(fā)行走，意識水平降低。

1.5 大鼠腦組織切片TTC染色測定腦梗死體積［8］大鼠腦缺血 2 h，再灌注 24 h，迅速斷頭取腦，將鼠腦-20℃凍10 min后在冰盤上進行冠狀切片，在視交叉切第1刀，在視交叉前3 mm切第2刀，在視交叉后3 mm切第3刀，在第3刀后3 mm切第4刀，將5片腦組織放入質(zhì)量濃度為20 g·L-1的TTC磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中，37℃避光恒溫孵育30 min，40 g·L-1多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定24 h后拍照。使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算腦梗死體積。梗死體積百分率/%＝（正常側(cè)大腦半球體積-梗死側(cè)非梗死區(qū)腦組織體積）/正常側(cè)大腦半球體積×100%。

1.6 免疫熒光檢測P2X7受體蛋白表達 大鼠腦缺血2 h，再灌注24 h，常規(guī)麻醉動物，開胸暴露心臟，經(jīng)左心室插灌注管至升主動脈并固定，同時右心耳剪一小洞放血，先快速灌注生理鹽水200 m l沖去全身血液，然后灌注4℃40 g·L-1多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定（pH 7.4），待大鼠全身僵硬后，斷頭取腦，將腦組織置于40 g·L-1多聚甲醛磷酸鹽緩沖液（pH 7.4），4℃后固定過夜，150、300 g·L-1蔗糖溶液脫水后，厚20μm冰凍切片，附于防脫載玻片上。1 ml·L-1Triton X-100磷酸鹽溶液洗5 min，微波修復(fù)15 min，山羊血清封閉20 min，兔抗鼠P2X7多克隆抗體（1∶150）4℃過夜，陰性對照用PBS代替一抗，Cy3標(biāo)記羊抗兔 IgG（1∶500）室溫2 h，DAPI復(fù)染核3 min，抗熒光淬滅封片液封片。熒光顯微鏡觀察并拍照，每只動物取3張腦片，隨機觀察損傷側(cè)大腦皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)，分別在400倍鏡下數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)目，求各平均值，分別代表該動物損傷側(cè)大腦皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)P2X7受體蛋白陽性表達細(xì)胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料用ˉx±s表示，多組之間顯著性檢驗用單因素方差分析；兩兩均數(shù)比較采用LSD檢驗，分類資料采用非參數(shù)檢驗中的Mann-Whitney U法。

2 結(jié)果

2.1 NaHS對腦缺血/再灌注損傷大鼠死亡率、神經(jīng)功能缺陷評分的影響 NaHS＋I/R組共用22只大鼠，死亡6只；I/R組共用28只大鼠，死亡12只；NaHS＋I/R組大鼠死亡率（27.27%）明顯低于I/R組（42.86%）。I/R組大鼠神經(jīng)功能缺陷評分明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01），NaHS＋I/R組大鼠神經(jīng)功能缺陷評分明顯低于I/R組（P＜0.05），見Tab 1。

Tab 1 The neurological impairment scores of rat in different groups

2.2 NaHS對腦缺血/再灌注損傷大鼠腦梗死體積的影響 TTC染色腦片顯示，假手術(shù)組兩側(cè)大腦半球呈均勻紅染，I/R組和NaHS＋I/R組正常腦組織染色為紅色，左側(cè)腦梗死組織呈蒼白色，且NaHS＋I/R組腦梗死體積百分率（21.88%±3.53%）明顯小于I/R組（36.71% ±3.73%）（P＜0.01），見Fig 1。

2.3 NaHS對腦缺血/再灌注損傷大鼠大腦皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)P2X7受體蛋白表達的影響 熒光顯微鏡下觀察，各組大鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)均可見P2X7受體免疫陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)呈紅色。與假手術(shù)組相比，I/R組損傷側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)P2X7陽性表達細(xì)胞數(shù)明顯增多（P＜0.01）；與I/R組相比，NaHS＋I/R組損傷側(cè)大腦皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)P2X7陽性表達細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01），見 Fig 2、3

3 討論

腦缺血是導(dǎo)致老年人死亡和殘疾的最常見的一種疾病，且隨著人口老齡化，其發(fā)病率還有增加的趨勢。目前治療腦缺血最有效的方法是盡快恢復(fù)大腦的血液供應(yīng)，臨床上常采用藥物或者介入手段改善腦血液循環(huán)，但在腦血流灌注恢復(fù)的過程中，由于鈣超載、氧自由基過飽和等產(chǎn)生的興奮性毒性作用會進一步加重腦組織的損傷，稱為腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷。所以腦缺血治療的研究不應(yīng)只局限于如何恢復(fù)腦組織血液供給，也應(yīng)該針對I/R損傷的機制采取措施。

Fig 1 Effects of NaHS on the volume percentage of cerebral infarction after cerebral ischem ia/reperfusion injury in rat（ˉx±s，n＝6）A：Brain sliceswith TTC staining；B：The volume percentage of cerebral infarction of rat in different groups.**P＜0.01 vs sham-operated group；＃＃P＜0.01 vs I/R group.

Fig 2 Effects of NaHS on expression of P2X7 receptor protein in cerebral cortex after cerebral ischem ia/reperfusion injury in rats（ˉx±s，n＝10）Cy3/DAPIdouble stained（×400，Scale bar＝30μm）a：Shamoperated group；b：I/R group；c：NaHS（25μmol·kg-1） ＋ I/R.**P＜0.01 vs sham-operated group；＃＃P＜0.01 vs I/R group.

Fig 3 Effects of NaHS on expression of P2X7 receptor protein in the hippocampal CA1 area after cerebral ischem ia/reperfusion injury in rats（±s，n＝10）Cy3/DAPIdouble stained（×400，Scale bar＝30μm）a：Shamoperated group；b：I/R group；c：NaHS（25μmol·kg-1）＋I/R.**P＜0.01 vs sham-operated group；＃＃P＜0.01 vs I/R group.

P2X7受體是嘌呤能受體P2X家族中非常獨特的一個亞型，是三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）門控的陽離子通道，廣泛分布于神經(jīng)細(xì)胞。在正常情況下，胞外微摩爾水平的ATP可激活P2X7受體，選擇性地引起Ca2＋、Na＋內(nèi)流，細(xì)胞去極化，神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生正常的興奮活動；然而腦缺血損傷時，損傷周圍細(xì)胞外出現(xiàn)高濃度（數(shù)個毫摩爾水平）ATP聚集［5］，P2X7受體在高濃度的細(xì)胞外ATP反復(fù)持久刺激下，可由陽離子通道轉(zhuǎn)變?yōu)榉沁x擇性膜孔，其通透性明顯增強，分子質(zhì)量較大的有機陽離子均可通過，進而激發(fā)NO、鈣超載、活性氧及炎性體的生成，導(dǎo)致細(xì)胞二次損傷甚至死亡［9］，因此，認(rèn)為P2X7受體可能在腦缺血后繼發(fā)性損傷中起關(guān)鍵作用。本研究通過建立短暫性大腦中動脈栓塞模型，發(fā)現(xiàn)腦缺血2 h，再灌注24 h損傷側(cè)腦皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)P2X7受體蛋白表達明顯高于假手術(shù)組，與王麗雁等［10］建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的研究結(jié)果相一致，同時本實驗還發(fā)現(xiàn)腦缺血2 h，再灌注24 h時可出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺陷和損傷側(cè)腦組織的梗死灶，與王春燕等［11］研究結(jié)果一致，這些提示腦I/R損傷后P2X7受體蛋白的高表達，可能造成細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的改變，導(dǎo)致細(xì)胞二次損傷甚至死亡，這或許是引發(fā)腦I/R后神經(jīng)功能缺陷和腦組織損傷的原因之一。另有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用P2X7受體拮抗劑亮藍(lán)G可明顯降低氧糖剝奪引起的神經(jīng)元死亡和MCAO后腦梗死體積［12］。因此，如何抑制P2X7受體的表達成為腦I/R損傷治療的研究熱點。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，哺乳類動物的許多細(xì)胞和組織都能產(chǎn)生H2S，它主要在胱硫醚-β-合成酶（cystathionineβ-synthase，CBS）、3-巰基丙酮酸轉(zhuǎn)硫酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3MST）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionineγ-lyase，CSE）的作用下生成，CBS和CES主要以半胱氨酸為底物，通過轉(zhuǎn)硫作用生成H2S，3MST可與半胱胺酸轉(zhuǎn)氨酶共同作用，以L-半胱氨酸和α-酮戊二酸為底物生成H2S，其中CBS和3MST在神經(jīng)系統(tǒng)中有表達，可使神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生內(nèi)源性H2S［13］。H2S在體內(nèi)發(fā)揮著廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，已有的研究表明，給予外源性H2S可對抗多種組織細(xì)胞的損傷而發(fā)揮保護作用［1-3］，本實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦I/R 12 h大鼠海馬、前腦皮質(zhì)組織中H2S含量、CBS活性、CBSmRNA及CBS蛋白表達均明顯高于假手術(shù)組，而腦I/R 24 h則均明顯低于假手術(shù)組，腦I/R 48 h硫化氫含量恢復(fù)到正常水平；且H2S供體化合物NaHS（25 μmol·kg-1）對腦I/R引起的神經(jīng)元損傷有保護作用［4］。本實驗進一步觀察了外源性H2S對腦缺血2 h，再灌注24 h時死亡率、神經(jīng)功能缺陷評分、腦梗死體積及腦組織中P2X7受體蛋白表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NaHS＋I/R組大鼠死亡率、神經(jīng)功能缺陷評分及腦梗死體積明顯低于I/R組，提示在腦I/R 24 h H2S/CBS體系下調(diào)的情況下，給予外源性H2S能明顯減輕腦I/R損傷的程度；并且本實驗還發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血2 h，再灌注24 h時，NaHS＋I/R組損傷側(cè)腦皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)P2X7受體蛋白表達明顯低于I/R組，這些提示H2S可能通過下調(diào)腦I/R損傷大鼠腦皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)P2X7受體蛋白的表達，減輕腦I/R損傷，從而改善腦I/R損傷后大鼠的死亡率、神經(jīng)功能缺陷評分和腦梗死體積，這可能是H2S發(fā)揮腦保護作用的機制之一，而這種保護機制是否通過調(diào)節(jié)腦I/R損傷后P2X7-Ca2＋信號途徑而起作用？這值得進一步研究。

參考文獻：

［1］ 孟金蘭，陳雅嘉，陳 紅，等.PI3K/Akt信號通路在硫化氫保護PC12細(xì)胞對抗化學(xué)性缺氧損傷的作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2013，29（2）：257-61.

［1］ Meng JL，Chen Y J，Chen H，etal.Role of PI3K/Akt in protective effect of hydrogen sulfide against PC12 cells injuries induced by chemical hypoxia［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（2）：257-61.

［2］ 張可璇，毛洪雅，孟 雪，等.PI3K/Akt調(diào)節(jié)線粒體Cx43蛋白表達在H2S后處理離體大鼠心肌中的保護作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2013，29（2）：248-53.

［2］ Zhang K X，Mao H Y，Meng X，et al.Cardioprotective effect of connexin 43 expression regulated by PI3K/Akton hydrogen sulfide postconditioning in isolated ischemic and reperfused rathearts［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（2）：248-53.

［3］ 張建新，丁艷艷，李蘭芳，等.硫化氫對急性缺血所致心肌細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2012，28（11）：1602-7.

［3］ Zhang JX，Ding Y Y，Li L F，et al.Effects of hydrogen sulfide on cardiomyocyte apoptosis induced by acutemyocardial ischemia in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（11）：1602-7.

［4］ Ren C L，Du A L，Li D L，et al.Dynamic change of hydrogen sulfide during global cerebral ischemia-reperfusion and its effect in rats［J］.Brain Res，2010，1345：197-205.

［5］ Bai H Y，Li A P.P2X（7）receptors in cerebral ischemia［J］.Neurosci Bull，2013，29（3）：390-8.

［6］ 方 芳，李 珍，王烈成，等.白藜蘆醇預(yù)處理對局灶性腦缺血/再灌注大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的保護作用和機制［J］.中國藥理學(xué)通報，2012，28（11）：1544-8.

［6］ Fang F，Li Z，Wang LC，etal.Protective effectsof preconditioning with resveratrol on focal cerebral ischemia/reperfusion induced neuronal apoptosis in rathippocampal CA1 region［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（11）：1544-8.

［7］ 陶 莉，望運玲，武雙嬋，等.丁香酚對大鼠局灶性腦缺血/再灌注神經(jīng)保護作用的研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2013，29（8）：1146-50.

［7］ Tao L，Wang Y L，Wu SC，etal.Neuroprotectiveeffectsofeugenol on cerebralischemia/reperfusion injury in rats［J］.Chin Phar-macol Bull，2013，29（8）：1146-50.

［8］ 程 鋼，秦媛媛，程 迪，等.氧化苦參堿對大鼠局灶性腦缺血損傷的保護作用及其抑制凋亡的作用機制［J］.中國藥理學(xué)通報，2013，29（3）：387-92.

［8］ Cheng G，Qin Y Y，Cheng D，et al.Protection of oxymatrine on focal crerebral ischemic injury in rats and itsmechanism of inhibition of opoptosis［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（3）：387-92.

［9］ Skaper SD，Debetto P，Giusti P.The P2X7purinergic receptor：from physiology to neurological disorders［J］.FASEB J，2010，24（2）：337-45.

［10］王麗雁，蔡文琴，陳鵬慧.P2X7受體在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后表達下調(diào)［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2009，31（22）：2171-4.

［10］Wang L Y，CaiW Q，Chen PH.Downregulation of P2X7receptor expression in neonatal rats after hypoxic-ischemic brain damage［J］.J Third Mil Med Univ，2009，31（22）：2171-4.

［11］王春艷，黃 萍，張朕華.3β-雙水楊酰薯蕷皂苷元對腦缺血/再灌注損傷大鼠的梗死體積及P13K/Akt信號通路的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2013，29（12）：1672-5.

［11］Wang C Y，Huang P，Zhang Z H.Effects of 3β-double salicyloyl diosgenin on infarct volume and PI3K/Akt signal path in rats with focal cerebral ischemia/reperfusion injury［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（12）：1672-5.

［12］Arbeloa J，Pérez-Samartín A，Gottlieb M，Matute C.P2X7receptor blockade prevents ATP excitotoxicity in neurons and reduces brain damage after ischemia［J］.Neurobiol Dis，2012，45（3）：954-61.

［13］Bucci M，Vellecco V，Cantalupo A，et al.Hydrogen sulfide accounts for the peripheral vascular effects of zofenopril independently of ACE inhibition［J］.Cardiovasc Res，2014，102（1）：138-47.