鄭里翔，蔡宇杰，孟憲明，徐敏娟，李昌偉，王巧鳳，王 月，廖祥儒

（1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西南昌 330004）

乳腺癌是嚴(yán)重威脅人類生命健康的重大疾病之一，現(xiàn)階段治療的主要手段是手術(shù)、放療 、化療，但對人體創(chuàng)傷較大，并且有嚴(yán)重的副作用，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，故研發(fā)毒副作用小、療效好的新型抗乳腺癌藥物尤為重要。近年來的研究表明：植物中色素毒副作用小，有較強(qiáng)的抗癌活性［1-2］。由于受到資源保護(hù)、環(huán)境因素等條件的限制，人們把注意力轉(zhuǎn)移到微生物產(chǎn)色素方面。鐮刀菌是真菌中一個常見且重要的種屬，在環(huán)境中分布極為廣泛，易培養(yǎng)、對營養(yǎng)物質(zhì)要求不高、且抗毒性強(qiáng)。過去人們的注意力多集中在鐮刀菌所產(chǎn)毒素的危害上，很少注意它們的有益之處［3-4］。本實驗室篩選的一株鐮刀菌（Fusarium sp JN158），它能產(chǎn)色素［5-6］，初步鑒定具有抑制乳腺癌等不同種類的腫瘤細(xì)胞增殖，但目前這類化合物的結(jié)構(gòu)、功效及機(jī)制尚不清楚。本課題將對鐮刀菌產(chǎn)色素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，并對其影響MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖及機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 葡萄糖、果糖、二甲基亞砜（DMSO）、三氟乙酸（TFA）等均為分析純，購自上海國藥集團(tuán)；四甲基偶氮唑鹽（MTT）：購自美國Sigma公司。鼠抗人VEGF單克隆抗體、鼠抗人Cyclin D1單克隆抗體、鼠抗人NF-κB p65單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco公司；烏苯美司購于上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.1.2 細(xì)胞株 人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.2 方法

1.2.1 鐮刀霉菌的培養(yǎng)及色素提取 從斜面培養(yǎng)基上挑取菌落，轉(zhuǎn)接到有種子培養(yǎng)基的三角瓶（250 ml三角瓶中裝液量50 ml），旋轉(zhuǎn)式搖床設(shè)定溫度30℃，200 r·min-1轉(zhuǎn)速培養(yǎng) 36 h，以5%的接種量接種到50 L的發(fā)酵罐中發(fā)酵72 h。發(fā)酵液經(jīng)10 000×g離心10 min，收集紫色菌體，加入4倍體積的95%酸性乙醇溶液（乙醇 ∶鹽酸＝9∶1）浸提過夜，得到色素提取液，用1 mol·L-1NaOH調(diào)pH至7.8左右，離心得到紫色沉淀，即為色素粗品。

1.2.2 LC/MS對色素組分的制備與分析 色素提取物經(jīng)LC/MS分離，通過Masslynx V4.1軟件分析出色素的主要組分及其分子質(zhì)量。

1.2.3 HPLC分離色素 分離條件為色譜柱Phecda C18（5μm，4.6 mm×250 mm），柱溫 25℃；DAD檢測器檢測波長254 nm；流量1.0 ml·min-1，進(jìn)樣量10μl，流動相A是含體積分?jǐn)?shù)0.1%TFA（氟乙酸）的乙腈，流動相B是含體積分?jǐn)?shù)0.1%TFA的蒸餾水梯度洗脫程序（Tab 1）。

Tab 1 Gradient program ofmobile phase

1.2.4 鐮刀霉菌發(fā)酵產(chǎn)紫色素結(jié)構(gòu)的分析

1.2.4.1 紫外光譜分析 取紫色素純品2 mg溶于乙腈-三氟乙酸（10∶1）中，通過 Waters Platform ZMD4000進(jìn)行液質(zhì)分析，液相掃描選擇的波長為200～750 nm，然后利用Masslynx V4.1軟件分析出該色素紫外圖譜。

1.2.4.2 紅外光譜分析 取紫色素純品2 mg，與200 mg干燥的KBr研磨混勻，用傅立葉變換紅外光譜儀在4000～400 cm-1區(qū)間掃描，掃描次數(shù)：32次，分辨率：4 cm-1。

1.2.4.3 核磁共振（NMR）分析 用氘代三氟乙酸將待測樣品溶于5 mm標(biāo)準(zhǔn)的NMR管中，加入少量TMS作為基準(zhǔn)參照物進(jìn)行測定。

1.2.5 MTT比色法測定不同濃度的色素對MCF-7細(xì)胞增殖的影響

1.2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將MCF-7細(xì)胞置于含10%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中貼壁生長，用0.25%胰酶消化傳代。

1.2.5.2 實驗分組與處理 將MCF-7細(xì)胞按上述方法培養(yǎng)，選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組（BG）、色素實驗組（EG）、色素對照組（EGC）、烏苯美司（UB，下同）組、烏苯美司對照組（UBC）。色素實驗組終濃度分別為 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15×10-3mmol·L-1，色素對照組加等體積鹽酸乙醇；烏苯美司溶解于含1%的冰醋酸培養(yǎng)基中，終濃度為10 mmol·L-1，對照組加等體積的含1%的冰醋酸培養(yǎng)基。MTT方法參照鄭里翔等［7］提供的方法，具體為將制好的含細(xì)胞的完全培養(yǎng)液加入96孔培養(yǎng)板中，對照組加入含等體積鹽酸乙醇或冰醋酸的新鮮完全培養(yǎng)液；陽性藥物烏苯美司終濃度為（IC50）10 mmol·L-1［8］。每組均為 15個復(fù)孔，選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度（A）值。抑制率（IR）＝（A對照-A藥物）/A對照×100%。

1.2.6 Western blot 用含色素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，冰浴 1 h，4℃12 000 r·min-1，離心 30 min，吸出上清液，即為細(xì)胞胞質(zhì)總蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)方法測定蛋白含量，以每孔8×10-2mg的蛋白量，SDS-PAGE電泳 、轉(zhuǎn)膜，BSA 37℃封閉2 h，加入BSA稀釋的鼠抗人 CyclinD1、VEGF、NF-κB p65單克隆抗體（1∶200），4℃過夜，加入標(biāo)記有 HRP的二抗（1∶2 000）37℃孵育2 h，ECL顯色，采用 FC-2凝膠成像系統(tǒng)（美國APHAR公司）分析蛋白表達(dá)量。蛋白的表達(dá)量通過灰度比值計算，即灰度比值＝目的條帶的灰度/βactin灰度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)采用ˉx±s表示。兩組間比較采用LSD、Hochberg、Games-Howell統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行統(tǒng)計處理。

2 結(jié)果

2.1 利用LC/MS及HPLC對鐮刀菌產(chǎn)色素的分離純化 鐮刀菌產(chǎn)色素經(jīng)過LC/MS分離，出現(xiàn)了6個主要峰，出峰時間分別為 2.67、3.14、3.64、3.74、4.18、5.36 min，總的時間大約是15 min。質(zhì)譜掃描后，通過Massly-nx V4.1軟件進(jìn)行分析，得到這6種組分的分子質(zhì)量分別為 354.0、368.0、368.0、382.0、368.0、382.0，分子質(zhì)量之間平均相差 14，其中，3種分子質(zhì)量為368.0，兩種分子質(zhì)量為382.0的應(yīng)該是結(jié)構(gòu)類似物。

同時，使用 HPLC分離色素，出現(xiàn)6個峰（圖1A），與LC/MS分析的出峰數(shù)基本上一致，分別標(biāo)記成Ⅰ～Ⅵ（Fig 1A），Ⅵ峰的峰相對最高，與周圍雜峰距離也較遠(yuǎn)，較易分離純化，所以只對這一組分進(jìn)行了制備，純度可達(dá)98%（Fig 1B）。

Fig 1 HPLC separates pigmentA：All peaks of the pigment；B：The peak of NO.6 pigment.

2.2 鐮刀菌產(chǎn)Ⅵ號色素峰結(jié)構(gòu)的鑒定

2.2.1 色素的紫外光譜分析 通過LC/MS的分析，得到該色素的紫外吸收光譜，該化合物在紫外區(qū)有兩條吸收帶，分別為253 nm和274 nm，可初步判斷該色素是一種帶苯環(huán)的化合物。

2.2.2 色素的質(zhì)譜分析 一級質(zhì)譜主要是用于分析目標(biāo)分子的分子質(zhì)量，該紫色素的一級質(zhì)譜圖，分子質(zhì)量為382.0。

2.2.3 色素的紅外光譜分析 紅外光譜是記錄有機(jī)分子吸收紅外光后，產(chǎn)生化學(xué)鍵振動而形成的光譜吸收，測定范圍一般為4 000～400 cm-1，常用來確定各種羧基、烷烴、芳環(huán)及炔烴等基團(tuán)的特征吸收峰。該紫色素的紅外光譜分析結(jié)果匯總見Tab 2。

Tab 2 The infrared spectrum results of purp le pigment

2.2.4 色素的核磁共振（NMR）分析

2.2.4.11H NMR圖譜分析 從圖譜的位移值及峰形來看，化學(xué)位移11.500為烯醇的H；化學(xué)位移5.384與芳環(huán)中的羥基中的 H一致；化學(xué)位移3.908為醇羥基中的H；化學(xué)位移4.550為甲氧基相連的CH2中的H；化學(xué)位移4.053與羥基相連的CH2的H一致；化學(xué)位移4.486為C＝C-OCH3中的H；化學(xué)位移3.527為C-C-OCH3中的H。

2.2.4.213C NMR圖譜分析 從圖譜的位移值及峰形來看，化學(xué)位移178.67、176.12與羧基中的C一致；化學(xué)位移53.12、53.71、55.68為甲氧基中的C，表明該色素含有3個甲氧基，其中2個是對位的，與氫譜結(jié)果一致；化學(xué)位移157.42為苯環(huán)中與羥基相連的C；化學(xué)位移為C＝C中接羥基的碳；化學(xué)位移56.27與C-OH中的C一致。

結(jié)合色素的性質(zhì)及質(zhì)譜與紅外的光譜分析，通過 COSY（correlated spectroscopy）、HMQC（heteronuclear multiple quantum coherece）、ROESY（rotaing frame overhauser effect spectroscopy）及 MLEV［M.Levitt（broadband composite decoupling sequence）］對1H、13C核磁共振譜峰進(jìn)行準(zhǔn)確的歸屬，確定了該色素的分子質(zhì)量為382.0，分子式為C17H18O10，結(jié)構(gòu)見Fig 2。

2.3 不同濃度的VI號化合物對MCF-7細(xì)胞增殖的影響 MTT比色法檢測鐮刀菌（Fusarium sp JN158）產(chǎn)VI號化合物對MCF-7腫瘤細(xì)胞增殖的影響。使用5～15μmol·L-19個不同濃度的VI號化合物作用于MCF-7細(xì)胞24 h，以烏苯美司（ubenimex，IC50）為陽性藥物。烏苯美司是從網(wǎng)狀橄欖鏈霉菌培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的一種具有抗菌作用和免疫增強(qiáng)作用的小分子二肽化合物，分子質(zhì)量約380，與VI相似，已有臨床研究表明烏苯美司可治療人乳腺癌、人白血病等［9］。通過酶聯(lián)免疫檢測儀而測出的490 nm波長下的各組吸光度（A）值，見Tab 3。

根據(jù)MTT比色法測得的A值，各實驗組（EG）的A值與對照組（Con）A值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；隨著該色素濃度的增加，對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制率（IR）逐漸升高，呈現(xiàn)濃度的依賴性。在11×10-3mmol·L-1時，腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率達(dá)50%，但對正常HUVEC細(xì)胞作用不明顯。由于UB（烏苯美司）IC50（10 mmol·L-1）的濃度是色素實驗組IC50濃度的900倍，說明VI化合物是一種活性成分非常高的化合物，可能是一種非常有前景的抗MCF-7乳腺癌細(xì)胞化合物。

2.4 鐮刀霉菌所產(chǎn)VI號化合物對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞內(nèi)CyclinD1、NF-KB p65、VEGF蛋白表達(dá)的影響 依據(jù)表3的研究結(jié)果，分別取11×10-3、13×10-3mmol·L-1二個濃度（簡稱 11、13）的Ⅵ化合物對癌細(xì)胞內(nèi)的 CyclinD1、NF-κB p65、VEGF蛋白表達(dá)影響進(jìn)行研究。

實驗結(jié)果表明：不同濃度的Ⅵ化合物作用MCF-7細(xì)胞 24 h后，NF-κB p65、VEGF、CyclinD1蛋白表達(dá)量均低于對照組，差異有顯著性（P＜0.01或P＜0.05，Tab 4），且隨藥物濃度增高，表達(dá)量逐漸下降；在Ⅵ化合物為11×10-3mmol·L-1（IC50）時，上述3種蛋白表達(dá)量與UB（烏苯美司）組比較無差異（P＞0.05，Tab 4，F(xiàn)ig 3）；當(dāng)色素濃度在 13×10-3mmol·L-1時，NF-κB p65、VEGF、CyclinD1蛋白的表達(dá)量差異雖然無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，Tab 4，F(xiàn)ig 3），但低于UB組，提示：Ⅵ色素化合物對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用可能與抑制 NF-κB p65、VEGF、CyclinD1蛋白表達(dá)有關(guān)。

Tab 3 Effect of com pounds of different concentrations on MCF-7 cancer cell proliferation

Tab 4 Effect of VI compound on protein expression±s）

Tab 4 Effect of VI compound on protein expression±s）

ΔP＜0.05；ΔΔP＜0.01 vs Control；*P＜0.05 vs UB

Group/×10-3mmol·L-1 CyclinD1NF-κB p65VEGF Control EG BG 1.21±0.38（8） - 1.28±0.32（7） - 1.29±0.23（6）Control EG Control EG-13 0.90±0.10 0.52±0.14*（7） 0.99±0.16 0.69±0.15ΔΔ（8） 0.86±0.12 0.51±0.13*ΔΔ（7）UB 0.87±0.12 0.64±0.08ΔΔ（5） 0.97±0.19 0.74±0.09Δ（4） 0.91±0.19 0.61±0.11ΔΔ（5）11 0.98±0.08 0.69±0.20Δ（6） 1.04±0.14 0.75±0.17Δ（7） 0.89±0.17 0.69±0.07Δ（8）

Fig 2 Structure of No.6 com pound

Fig 3 W estern blot of CyclinD1，NF-κB p65，VEGF protein

3 討論

通過篩選天然產(chǎn)物和它們的結(jié)構(gòu)類似物發(fā)現(xiàn)抗腫瘤藥物，是目前較為通行的做法。近年來的研究表明，天然植物、水果、蔬菜等分離的色素（如胡蘿卜素、番茄紅素、姜黃素、花青苷類等）具有抗腫瘤的活性［10-12］。然而，受到植物的生長周期長、季節(jié)等因素的限制，人們把注意力轉(zhuǎn)移到微生物上，因微生物生長不受環(huán)境、空間的限制，且代謝產(chǎn)物種類繁多，可以為天然色素的開發(fā)提供廣闊的空間。如目前已經(jīng)大量的研究證明的靈菌紅素（PGs），是由微生物（如粘質(zhì)沙雷菌、革蘭陰性細(xì)菌）產(chǎn)生的天然紅色素，其抗腫瘤潛在活性已經(jīng)得到廣泛的證實。靈菌紅素有共同的結(jié)構(gòu) PPM（pyrrolylpyrromethene），該家族在不同的細(xì)菌均可產(chǎn)生，PGs是一類起免疫抑制作用的色素，體外的研究表明可以促凋亡抗腫瘤活性。另外，葉明等從暗盤菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物中提取了一種較穩(wěn)定的黑色素；趙東紅等用一株鏈霉菌進(jìn)行液體深層發(fā)酵，并從發(fā)酵代謝物中獲得了藍(lán)色的天藍(lán)菌素（coelicolorin）［10］。雖然已對微生物來源的天然色素進(jìn)行了大量的研究工作，但對鐮刀菌為產(chǎn)生菌的天然紅色素的研究報道較少。目前，尚未見鐮刀菌Fusarium spJN158產(chǎn)色素抗腫瘤活性的研究報道。

本研究結(jié)果表明：鐮刀菌（Fusarium spJN158）產(chǎn)色素具有其獨特之處，該色素的混合物溶解于酸乙醇中（pH 1～2），呈現(xiàn)鮮紅，當(dāng)pH調(diào)節(jié)至7～8（用NaOH調(diào)節(jié)pH值）時，出現(xiàn)紫黑色沉淀。沉淀的色素通過HPLC分離，可得到6個不同的峰。其中Ⅵ號峰遠(yuǎn)離前5個峰，便于分離（Fig 1B）。從其分離的結(jié)果表明，純度較高，可達(dá)98%（Fig 2B）。通過紅外、質(zhì)譜、核磁共振對VI色素化合物的結(jié)構(gòu)分析可知：此色素可能是一種花青苷類色素，分子質(zhì)量為382，結(jié)合有機(jī)元素實驗數(shù)據(jù)，推測此色素可能的分子式是C17H18O10。通過數(shù)據(jù)庫查新可知，沒有這種分子式報道，考慮到該色素特殊的溶解性，可能是一種新的骨架結(jié)構(gòu)，值得進(jìn)一步研究。

由于該化合物的結(jié)構(gòu)獨特，本實驗室對其活性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：該化合物對肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌及大腸癌均有不同程度的抑制作用（數(shù)據(jù)未在文章中顯示），并呈現(xiàn)濃度的依賴性，尤其是對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用明顯（P＜0.01），在濃度11×10-3mmol·L-1時，腫瘤細(xì)胞的抑制率可達(dá)50%；而陽性藥物烏苯美司的IC50為10 mmol·L-1，是VI色素化合物的900倍，說明該化合物可能是一種抗乳腺癌活性非常高的小分子化合物。

為研究VI色素化合物對MCF-7細(xì)胞的抑制作用機(jī)制，課題組選用11、13×10-3mmol·L-12個不同濃度的VI號化合物，分別對腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤轉(zhuǎn)移起重要作用的CyclinD1、NF-κB及VEGF基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行研究，結(jié)果證實：上述2個不同濃度的VI號化合物對 MCF-7細(xì)胞中CyclinD1、NF-κB p65、VEGF蛋白表達(dá)均有不同的抑制作用，并呈現(xiàn)濃度的依賴性（P＜0.05或P＜0.01）。

由于CyclinD1與乳腺癌發(fā)生、進(jìn)展緊密相關(guān)，乳腺細(xì)胞內(nèi) Cyc1inD1過度表達(dá)，形成 CyclinD1-CDK4/6復(fù)合物明顯增多，大量CDK4/6被磷酸化，激活其介導(dǎo)的pRB磷酸化路徑，使乳腺細(xì)胞失控性生長，導(dǎo)致乳腺癌的形成。抑制CyclinD1表達(dá)則可以控制腫瘤細(xì)胞的增殖速度，減緩腫瘤的進(jìn)展［13］。

核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B（NF-κB）是腫瘤細(xì)胞增殖重要的調(diào)控因子，所調(diào)控的基因有180種之多，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）。VEGF的啟動子上有NF-κB的特異性結(jié)合靶點，封閉裸鼠乳腺癌中NF-κB的表達(dá)，VEGF等多種促血管生成因子的表達(dá)下降［14］，說明 NF-κB在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用［15］。故 VI號化合物抑制 CyclinD1、NF-κB、VEGF蛋白表達(dá)，從而抑制了 MCF-7細(xì)胞的增殖。

由于花青苷類色素是黃酮類化合物，在天然植物中的分布最廣，已經(jīng)證實具有抗菌、抗腫瘤的活性［16］。但每種色素抗腫瘤活性的機(jī)制不同，故鐮刀菌產(chǎn)VI號化合物抑制MCF-7細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能是抑制 CyclinD1、NF-κB、VEGF的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。當(dāng)然上述的這些機(jī)制，可能只是抗腫瘤活性的一個方面，其更為重要的作用機(jī)制將是本課題組今后研究的重要工作。

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