王艷華，張慧萍，田 玨，周龍霞，陳久凱，馬文斌，孔繁琪，趙 麗，劉現(xiàn)梅，韓學(xué)波，楊曉玲，姜怡鄧

（寧夏醫(yī)科大學(xué)1.檢驗(yàn)學(xué)院、2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、3.總醫(yī)院，寧夏 銀川 750004）

妊娠期高血壓疾?。╤ypertension disorder complicating pregnancy，HDCP）是孕婦因妊娠后內(nèi)環(huán)境改變致滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙為主要病理特征的妊娠期特有疾病之一［1］，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍生兒死亡的重要原因，但其病因至今未明。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡在滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤、遷移及胎盤種植的過程中可能發(fā)揮重要作用，且與HDCP發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)［2］。胎盤是母體與胎兒間進(jìn)行物質(zhì)交換的關(guān)鍵靶器官，滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡在胎盤形成、發(fā)育以及整個(gè)妊娠過程中起重要作用。目前，研究認(rèn)為NO在調(diào)節(jié)胎盤血管阻力，保持子宮胎盤血液循環(huán)暢通及調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞分化等方面具有重要作用［3］。另外，有研究報(bào)道，胎盤局部NO水平下降，可直接導(dǎo)致胎盤組織發(fā)生上述影響滋養(yǎng)細(xì)胞的病理改變，因此，可認(rèn)為胎盤局部NO合成下降與胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞病理改變密切相關(guān)。同時(shí)，研究表明，NO參與細(xì)胞凋亡的生物調(diào)節(jié)［4］，氧化應(yīng)激是造成細(xì)胞凋亡的重要環(huán)節(jié)［5］。然而，NO是否可以通過氧化應(yīng)激調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)選取人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞為研究對象，通過一氧化氮合酶（NOS）抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）有效抑制NO的合成，觀察NO水平下降對人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的影響，并探討氧化應(yīng)激在其中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑及細(xì)胞培養(yǎng) 人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞株（HTR-8）來源于復(fù)旦IBS細(xì)胞庫；DMEM F12培養(yǎng)基、胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和0.1 g·L-1鏈霉素均購自Gibco公司；L-NAME購自Sigma公司；Annexin VFITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自貝博試劑公司；一氧化氮（NO）、總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白含量檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。采用DMEM F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞（含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和0.1 g·L-1鏈霉素），培養(yǎng)條件為37℃，5%的CO2。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組 將HTR-8細(xì)胞分為對照組（0μmol·L-1的 L-NAME）和實(shí)驗(yàn)組，每組 3例樣品。實(shí)驗(yàn)組分別用不同濃度的L-NAME（10、100、500、1 000μmol·L-1）干預(yù)。

1.3 四甲基偶氮唑藍(lán)染色法（M TT法）測定細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，制成每毫升5×104個(gè)細(xì)胞的懸液接種，培養(yǎng)24 h后，各組分別加入相應(yīng)藥物孵育24、48 h，吸棄液體，加入終濃度0.5 g·L-1MTT 100μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，加入DMSO 150μl，微量震蕩10min，于酶標(biāo)儀上490 nm測定各孔吸光度（A）值，通過與對照組比較求出存活率。存活率/%＝實(shí)驗(yàn)組吸光度（A）值/對照組吸光度（A）值×100%。

1.4 Annexin V-FITC檢測細(xì)胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，300×g，2～8℃，離心5min，棄培養(yǎng)基。冷PBS洗滌細(xì)胞2次。用400μl 1×Annexin V結(jié)合液懸浮細(xì)胞，濃度大約為1×109cells·L-1。在懸液中加入5μl Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻后，于2～8℃避光孵育15 min，加入10μl PI染色液后混勻，避光孵育5min，立即用美國BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 細(xì)胞電鏡標(biāo)本制備 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，收集于離心管中，800 r·min-1離心沉淀，用預(yù)冷的2.5%戊二醛磷酸緩沖液（pH 7.4）固定30 min，0.1 mol·L-1磷酸緩沖液洗15 min，重復(fù)3次；1%鋨酸（pH 7.4）固定30 min，再用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液洗 15 min，共 3次；乙醇逐級脫水后，浸透，Epon812膠囊內(nèi)包埋，聚合；超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色；采用日立HITACHIH-7650透射電鏡觀察并取圖。

1.6 NO、T-AOC、SOD和MDA的檢測 用橡皮刮子刮下細(xì)胞，1 000 r·min-1，離心 10 min，棄上清，1 ml PBS輕輕吹打，1 000 r·min-1，離心 10 min，棄上清，重懸于0.5 ml緩沖液中，超聲破碎細(xì)胞。上述樣本用凱基BCA蛋白含量檢測試劑盒測定蛋白濃度，按相應(yīng)試劑盒說明書檢測NO、T-AOC、SOD和MDA水平，并計(jì)算結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以ˉx±s表示，多樣本均數(shù)間比較采用One-way ANOVA檢驗(yàn)，組間兩兩比較用 Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，兩個(gè)變量相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1 L-NAME對人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞存活率的影響不同濃度的L-NAME干預(yù)HTR-8細(xì)胞24、48 h后，MTT法檢測并計(jì)算各組細(xì)胞存活率。干預(yù)24 h對細(xì)胞的存活率無明顯影響，然而，干預(yù)HTR-8細(xì)胞48 h后，與對照組比較，從 100μmol·L-1的 LNAME組開始細(xì)胞增殖受到明顯抑制，其細(xì)胞存活率呈現(xiàn)隨著劑量增大而逐漸下降的趨勢，結(jié)果提示L-NAME對HTR-8細(xì)胞生長有抑制作用。見Fig 1。

2.2 L-NAME引起人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞NO水平下降與對照組比較，100、500、1 000μmol·L-1的 LNAME組滋養(yǎng)細(xì)胞中NO水平明顯降低（P＜0.01）。見Fig 2。

2.3 L-NAME對人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的影響 不同濃度的L-NAME干預(yù)HTR-8細(xì)胞后，Annexin-V FITC染色、流式細(xì)胞定量定性分析結(jié)果顯示：隨著L-NAME濃度的增加，細(xì)胞凋亡數(shù)也逐漸增加（P＜0.01），呈劑量依賴關(guān)系。以上提示，L-NAME可誘導(dǎo)HTR-8細(xì)胞發(fā)生凋亡。見Fig 3。

Fig 1 Effect of L-NAME on survival rate of HTR-8 cells*P＜0.05 vs control group

Fig 2 Levels of NO after different concentrations of L-NAME intervenes HTR-8 cells**P＜0.01 vs control group

Fig 3 Effects of L-NAME on HTR-8 cells apoptosisA，B：Quantification of cell apoptosis by flow cytometer.In each panel，the lower rightquadrant indicated the apoptotic cells.a：Control group；b：10 μmol·L-1 L-NAME group；c：100μmol·L-1 L-NAME group；d：500μmol·L-1 L-NAME group；e：1 000μmol·L-1 L-NAME group.**P＜0.01 vs control group

2.4 NO水平與細(xì)胞凋亡數(shù)相關(guān)性分析 為了進(jìn)一步明確NO水平降低與凋亡的關(guān)系，將NO水平與細(xì)胞凋亡數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：NO水平與細(xì)胞凋亡數(shù)（r＝-0.5210）呈負(fù)相關(guān)，因此，NO水平降低與滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡存在因果關(guān)系。見Fig 4。

2.5 透射電鏡觀察滋養(yǎng)細(xì)胞超微病理結(jié)構(gòu)改變對照組細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核核膜光滑，染色質(zhì)均勻，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基器豐富，線粒體內(nèi)外膜完整，嵴結(jié)構(gòu)清楚；10μmol·L-1L-NAME組可見細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核核膜完整，核仁明顯，細(xì)胞器有輕度擴(kuò)張或可見致密型線粒體；100μmol·L-1L-NAME組染色質(zhì)凝集或邊集，線粒體腫脹或濃縮、嵴斷裂或溶解，甚至消失，形成空泡，可見凋亡小體（箭頭所指）；500μmol·L-1L-NAME組細(xì)胞膜完整，染色質(zhì)略微聚集凝固，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量空泡，線粒體腫脹、嵴斷裂或溶解，甚至消失；1 000μmol·L-1L-NAME組細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，核膜固縮不規(guī)則，染色質(zhì)凝集或邊集，似凋亡前體（箭頭所指），細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量空泡。見Fig 5。

2.6 不同濃度L-NAME干預(yù)HTR-8細(xì)胞后TAOC、SOD及MDA的變化 結(jié)果顯示，與對照組比較，100、500、1 000μmol·L-1的 L-NAME組細(xì)胞中T-AOC、SOD水平明顯降低（P＜0.05），而 500、1 000μmol·L-1的L-NAME組細(xì)胞中MDA的含量明顯升高（P＜0.05）。見Fig 6。

2.7 T-AOC、SOD及MDA含量與細(xì)胞凋亡數(shù)相關(guān)性分析 為了進(jìn)一步確定氧化應(yīng)激在HTR-8細(xì)胞凋亡中起作用，將細(xì)胞內(nèi)T-AOC、SOD及MDA含量與細(xì)胞凋亡數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：細(xì)胞凋亡數(shù)與 T-AOC（r＝-0.3212）、SOD（r＝-0.2779）水平呈負(fù)相關(guān)，與MDA（r＝0.2807）含量呈正相關(guān)。見Fig 7。

Fig 4 Scatter p lots of Spearman correlation coefficient corresponding between apoptosis and NO content in HTR-8 cells

Fig 5 Characteristics of trophoblast cell ultrastructure under electron m icroscopeA：Control group；B：10μmol·L-1 L-NAME group；C：100μmol·L-1 L-NAME group；D：500μmol·L-1 L-NAME group；E：1 000μmol·L-1 L-NAME group

3 討論

近年來研究已證實(shí)，妊娠過程中胎盤組織存在滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，且對滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、浸潤及胎盤種植有重要調(diào)節(jié)作用。胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡過度可能導(dǎo)致胎盤淺著床，造成子宮螺旋動(dòng)脈重建失敗，最終出現(xiàn)胎盤血液灌注量減少而引發(fā)HDCP的發(fā)生，提示胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象可能是HDCP發(fā)生、發(fā)展的核心環(huán)節(jié)［2］，但滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制有待研究。研究表明［6］，HDCP患者血漿NO較正常孕婦明顯下降，其下降的程度與病情嚴(yán)重程度呈正比，提示，妊娠期間NO分泌不足可能是HDCP的重要致病因素之一。適量的NO水平是保證子宮胎盤循環(huán)低阻、低壓、高流量的關(guān)鍵，這是機(jī)體對正常妊娠的保護(hù)性機(jī)制。另外，有研究報(bào)道，NO對細(xì)胞凋亡起著雙向調(diào)控作用，在某些細(xì)胞中，NO可以促進(jìn)凋亡，而在另外一些細(xì)胞（如肝細(xì)胞）中卻可以抑制凋亡。例如，NO可介導(dǎo)一些細(xì)胞保護(hù)性基因如熱休克蛋白HSP70和 HSP32的表達(dá)，從而抵抗 TNF-α、氧離子和亞硝酸鹽離子等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［7］。NO水平下降是否可調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡及其機(jī)制有待進(jìn)一步研究，因此，本研究采用 NOS抑制劑（LNAME）干預(yù)人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞，間接觀察NO水平降低對人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的影響。研究結(jié)果顯示：不同濃度的L-NAME干預(yù)HTR-8細(xì)胞后，導(dǎo)致細(xì)胞存活率及NO水平的降低，并引起HTR-8細(xì)胞發(fā)生凋亡，電鏡結(jié)果在100、1 000μmol·L-1L-NAME組可見凋亡小體及凋亡前體，而500μmol·L-1LNAME組凋亡不明顯，這可能由于電鏡有其局限性，樣品定位和圖像分析困難，觀察視野小，視野可能沒有捕捉到，結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果，500 μmol·L-1L-NAME組存在明顯的凋亡。為了進(jìn)一步明確NO水平與滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系，將HTR-8細(xì)胞內(nèi)NO水平與細(xì)胞凋亡數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，NO水平與細(xì)胞凋亡數(shù)呈負(fù)相關(guān)。因此，NO水平降低與滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡存在因果關(guān)系，但其機(jī)制有待探討。

已有證據(jù)表明，氧化應(yīng)激在HDCP發(fā)病機(jī)制中也起著關(guān)鍵作用，和正常妊娠相比，HDCP患者胎盤中脂質(zhì)過氧化物增加，抗氧化酶減少［8］。研究表明，活性氧所致的氧化應(yīng)激是造成細(xì)胞凋亡的重要環(huán)節(jié)。正常情況下，機(jī)體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，所以對機(jī)體并無有害影響。而多種有害刺激可打破這種平衡，致活性氧大量生成而超過抗氧化系統(tǒng)的清除能力，機(jī)體就會(huì)形成氧化應(yīng)激狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致病理損傷。NO是體內(nèi)產(chǎn)生的血管舒張因子，除可調(diào)節(jié)血壓外，在清除自由基等方面也起著重要作用。研究表明［9］，NO以多種形式保護(hù)細(xì)胞免受過氧化損傷，包括與多種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物以近擴(kuò)散速率進(jìn)行反應(yīng)，阻止脂質(zhì)過氧化鏈，甚至抑制細(xì)胞凋亡。為了證實(shí)NO水平降低引起滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡是否通過氧化應(yīng)激，我們檢測了氧化應(yīng)激指標(biāo)。正如結(jié)果所示，100、500、1 000 μmol·L-1的L-NAME組 T-AOC、SOD水平降低，而MDA的含量升高。SOD是體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的第一道防線，在阻止自由基和脂質(zhì)過氧化對機(jī)體的損害方面起關(guān)鍵作用［10］。SOD活性下降引發(fā)脂質(zhì)過氧化物在金屬離子存在下催化裂解產(chǎn)生MDA。通常MDA用來間接反映氧自由基的存在及對細(xì)胞的損傷程度，MDA對細(xì)胞有毒性作用，可與蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間交聯(lián)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡［11］。為了進(jìn)一步確定氧化應(yīng)激在HTR-8細(xì)胞凋亡中起作用，將HTR-8細(xì)胞內(nèi)T-AOC、SOD及MDA含量與細(xì)胞凋亡數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡數(shù)與HTR-8細(xì)胞內(nèi)T-AOC、SOD含量呈負(fù)相關(guān)，與MDA含量呈正相關(guān)，提示NO水平降低引起HTR-8細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡可能是HDCP致病的機(jī)制之一。

綜上所述，NO水平降低能夠誘導(dǎo)人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，而NO水平降低引起的氧化應(yīng)激可能是其重要機(jī)制之一，這對于深入探討NO分泌不足引起HDCP提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Fig 7 Scatter p lots of Spearman correlation coefficient corresponding between apoptosis and T-AOC，SOD and MDA content in HTR-8 cells

參考文獻(xiàn)：

［1］ Longtine M S，Barton A，Chen B，et al.Live-cell imaging shows apoptosis initiates locally and propagates as a wave throughout syncytiotrophoblasts in primary cultures of human placental villous trophoblasts［J］.Placenta，2012，33（12）：971-6.

［2］ 劉美玲，彭景梗.滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡調(diào)控的研究［J］.生理科學(xué)進(jìn)展，2004，35（4）：335-7.

［2］ Liu M L，Peng JG.Study on the regulation of apoptosis of trophoblast cells［J］.Progr Physiol Sci，2004，35（4）：335-7.

［3］ Sladek SM，Magness RR，Conrad K P.Nitricoxide and pregnancy［J］.Am JPhysiol，1997，272（2Pt2）：R441-63.

［4］ Kim YM，Talanian R V，Billiar TR.Nitric oxide inhibits apoptosis bypreventing increases in caspase-3-like activity via two distinct mechanisms［J］.JBiol Chem，1997，272（49）：31138-48.

［5］ 張駿艷，姚 華，李 晟，等.Urantide對大鼠心肌缺血/再灌注后心肌細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2013，29（5）：648-54.

［5］ Zhang JY，Yao H，Li S，et al.Regulation of urantide in PI3K/Akt and PKC signaling transduction inmyocardial ischemia-reperfusion injury to relieve the cardiomyocyte apoptosis in rats and itsmechanism［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（5）：648-54.

［6］ Shaarnash A H，Elsonosy E D，ZakhariM M，et al.Placental nitric oxide synthase（NOS）aetivity and nitric oxide（NO）production in normal pregnancy，precelampsia and eclampsia［J］.Int JGynaecol Obstet，2001，72（2）：127-33.

［7］ Kim YM，de Vera M E，Watkins SC，etal.Nitric oxide protects culured rat hepatocytes from tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis by inducing heatshock protein 70 expression［J］.JBoil Chem，1997，272（2）：1402-11.

［8］ Huang Q T，Zhang M，Zhong M，et al.Advanced glycation end products as an upstream molecule triggers ROS-induced sFlt-1 production in extravillous trophoblasts：a novel bridge between oxidative stress and preeclampsia［J］.Placenta，2013，34（12）：1177-82.

［9］ BeligniM V，F(xiàn)ath A，Bethke PC，et al.Nitric oxide acts as an antioxidant and delays programmed cell death in barley aleurone lay-ers［J］.Plant Physiol，2002，129（4）：1642-50.

［10］Zelko IN，Mariani T J，F(xiàn)olz R J.Superoxide dismutasemultigene family：a comparison of the CuZn-SOD（SOD1），Mn-SOD（SOD2），and EC-SOD（SOD3）gene structures，evolution，and expression［J］.Free Radic Biol Med，2002，33（3）：337-49.

［11］張 敏，朱 穎，胡 波，等.A-actinin-4與多柔比星腎病大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)的關(guān)系［J］.實(shí)用兒科臨床雜志，2009，24（5）：358-60.

［11］Zhang M，Zhu Y，Hu B，et al.The relationship between A-actinin-4 and the oxidative stress of doxorubicin nephropathy rats［J］.J Appl Clin Pediatr，2009，24（5）：358-60.