朱小麗，劉硯星，種寶貴，馬紅芳，江 平，張曉燕

（1.河北醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，河北省新藥藥理毒理研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊 050017；2.河北省哈勵(lì)遜國際和平醫(yī)院，河北衡水 053000）

耳鳴是一種常見的聽覺系統(tǒng)疾病，其特點(diǎn)是在無外部相應(yīng)聲源的情況下耳內(nèi)出現(xiàn)的幽靈般的鈴音或蜂鳴聲，是一種主觀的聲音感覺［1］。大量研究顯示水楊酸鈉會(huì)導(dǎo)致耳鳴［2-4］，因此水楊酸鈉成為研究耳鳴發(fā)生機(jī)制的重要工具藥。Liu等［5］通過觀察水楊酸鈉對顳皮層上延遲整流鉀離子通道的影響，證實(shí)了耳鳴與聽覺中樞有關(guān)。耳鳴通常伴隨失眠、厭煩等不良情緒，許多臨床醫(yī)生已經(jīng)注意到了耳鳴和情緒狀態(tài)之間的聯(lián)系［6］。影像學(xué)研究已證實(shí)，耳鳴和抑郁癥之間存在激活的神經(jīng)回路，噪音創(chuàng)傷后耳鳴的動(dòng)物模型和抑郁癥的動(dòng)物模型都伴有海馬神經(jīng)元的損傷［7］。實(shí)際上認(rèn)知行為療法對某些耳鳴患者是有效的［8］。這些耳鳴和情緒反應(yīng)之間的聯(lián)系使一些學(xué)者提出邊緣系統(tǒng)參與耳鳴不良情緒的形成這一觀點(diǎn)［9］。Mirz等［10］利用 PET技術(shù)對 8名耳鳴患者和8名健康志愿者進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)患者的右前額葉、右顳葉腦區(qū)的腦血流量明顯增加，同時(shí)左半腦區(qū)的邊緣系統(tǒng)的杏仁核部位的腦血流量也有所增加。同時(shí)，Mirz等［11］還對12名健康志愿者進(jìn)行研究，利用噪音來模擬耳鳴的心理聲學(xué)特征及其對患者造成的情感反應(yīng)，再利用PET檢測大腦局部血流分布的改變。該研究發(fā)現(xiàn)這些聲音刺激引起初級(jí)聽皮層、次級(jí)聽皮層、背外側(cè)額葉以及與情感相關(guān)的邊緣系統(tǒng)腦血流的增加，證明邊緣系統(tǒng)可能與耳鳴的感知和情緒產(chǎn)生有關(guān)。Lockwood等［12］應(yīng)用PET研究大腦的代謝活動(dòng)，通過觀察大腦對去氧葡萄糖的攝取情況，發(fā)現(xiàn)耳鳴患者不僅Brodmann41區(qū)域（即原始聽區(qū)域）的代謝活動(dòng)增強(qiáng)，邊緣系統(tǒng)也出現(xiàn)異常的代謝活動(dòng)，聽覺系統(tǒng)和邊緣系統(tǒng)間存在著異常構(gòu)成聯(lián)系，耳鳴與顳橫回、顳上回、顳下回及海馬等腦區(qū)的活動(dòng)有關(guān)。同時(shí)，他還用15O標(biāo)記的H215O作為示蹤劑，通過PET觀察了4例均能通過口面隨意運(yùn) 動(dòng) （performing voluntary oral facial movements，OFM）改變耳鳴響度的耳鳴患者，在其靜息狀態(tài)、口面活動(dòng)期間及給予聲音信號(hào)時(shí)的腦血流變化，發(fā)現(xiàn)耳鳴響度增加時(shí)對側(cè)聽皮層腦血流增加，而且聲音信號(hào)在耳鳴患者腦內(nèi)引起腦活動(dòng)的區(qū)域比正常人更廣泛，它包括初級(jí)聽皮層、島葉、海馬、邊緣系統(tǒng)、丘腦等，同時(shí)還觀察到聽覺系統(tǒng)與海馬存在著異常聯(lián)系，為邊緣系統(tǒng)參加耳鳴感覺形成的推論提供了依據(jù)［12］。有研究顯示興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸［12］和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸［13］與耳鳴的形成關(guān)系密切，而電壓門控性鈣通道（voltage-gated calcium channels，VGCC）與神經(jīng)遞質(zhì)釋放及激素分泌密切相關(guān)［11］。所以，本研究利用腦片膜片鉗技術(shù)，觀察水楊酸鈉對大鼠海馬神經(jīng)元電壓門控性鈣離子通道電生理學(xué)特性的影響。

1 材料與方法

1.1 腦片制備 選用健康14 d齡的SD大鼠，快速斷頭，掀開顱骨，完全斷開腦神經(jīng)，完整剝離出全腦，使腦組織在0～4℃預(yù)先氧飽和（95%O2＋5%CO2）的人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF）中冷卻。按冠狀切面修整剝離出的全腦，用濾紙吸干表面的ACSF，用氰丙烯酸鹽膠垂直粘在切片機(jī)上已事先固定好的瓊脂制標(biāo)本托上。將標(biāo)本槽快速充滿0～4℃預(yù)先氧飽和（95%O2＋5%CO2）的ACSF，使全腦浸埋其中，并持續(xù)通氣。將其用振動(dòng)切片機(jī)切成300μm厚的腦片，然后將腦片移至孵育槽內(nèi)，持續(xù)通氣，在溫度為（30～32）℃下，孵育1 h。

ACSF：NaCl 119， MgCl21.3， KCl 5.4，NaH2PO4·2H2O 1，NaHCO326.2，D-Glucose 11，CaCl22.5，濃度單位為 mmol·L-1，pH值調(diào)節(jié)至7.35～7.40，并用0.22μm孔徑的微孔濾膜濾過。

1.2 全細(xì)胞膜片鉗記錄 將孵育好的腦片置于灌流槽中，浸沒于液面下約3～4 mm。用蓋網(wǎng)固定法固定腦片，用氧飽和的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液進(jìn)行持續(xù)灌流，流速約為3 ml·min-1。利用紅外微分干涉相差顯微鏡，通過圖像采集軟件成像于計(jì)算機(jī)監(jiān)視器屏幕上，觀察并選擇狀態(tài)良好的海馬神經(jīng)元進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將硬質(zhì)有芯玻璃毛坯管拉制成電阻為4～6Ω的玻璃微電極，從微電極尾部充灌電極內(nèi)液，然后通過微電極操縱器引導(dǎo)電極到達(dá)記錄部位，到達(dá)記錄部位后釋放正壓、給予負(fù)壓，形成高阻抗（＞1 GΩ）封接，再繼續(xù)施以負(fù)壓吸破細(xì)胞膜，形成全細(xì)胞記錄模式。

ICa的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液：TEA 140，CsCl 5，HEPES 10，D-Glucose 11，BaCl25，MgCl21，TTX 0.01.濃度單位均為mmol·L-1，將pH值調(diào)至7.35，并用孔徑為0.22μm的微孔濾膜濾過。

ICa的電極內(nèi)液：CsCl 110，HEPES 10，EGTA 10，TEA 30，Mg-ATP 5，Na-GTP 0.3，濃度單位均為mmol·L-1，將pH值調(diào)至7.2，并用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜濾過。

1.3 給藥方式 以標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液為溶媒，配制不同濃度的水楊酸鈉溶液。采取灌流方式給藥。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析 采用EPC-10軟件（HECK公司）收集所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用Origin 7.5軟件分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用ˉx±s表示。采用配對t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組數(shù)據(jù)間的比較。

2 結(jié)果

2.1 水楊酸鈉對海馬神經(jīng)元鈣電流的抑制作用鉗制電壓-50 mV，給以10 mV持續(xù)200 ms的去極化脈沖得到的電流即ICa。采用灌流法給予不同濃度（分別為 0.1、0.3、1、3、10 mmol·L-1）的水楊酸鈉，觀察水楊酸鈉對ICa的影響。以水楊酸鈉作用的效應(yīng)率為縱坐標(biāo)，水楊酸鈉的濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到濃度 -效應(yīng)關(guān)系曲線（Fig 1）。加入0.1、0.3、1、3、10 mmol·L-1的水楊酸鈉后，ICa幅度分別減小為加藥前的（94.56±1.07）%、（84.48±1.02）%、（63.39±1.37）%、（40.47±3.57）%、（23.42 ±3.90）%。按照Hill方程對濃度-效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行擬合。擬合后的濃度-效應(yīng)曲線的半抑制濃度IC50為1.64 mmol·L-1，Hill系數(shù)h為0.22。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水楊酸鈉對ICa有抑制作用，而且這種抑制作用具有劑量/濃度依賴性。本實(shí)驗(yàn)的水楊酸鈉的實(shí)驗(yàn)濃度選為1 mmol·L-1。

Fig 1 Dose response inhibition of sodium salicylate on I Ca

Fig 2 Effect of 1mmol·L－1 salicylate on the I-V relationship of peak I CaA：Original current traces of control I Ca；B：Original current traces of I Ca after 1 mmol·L-1 salicylate application；C：Peak I-V curves for control and 1 mmol·L-1 salicylate.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control.

Fig 3 Effect of 1 mmol·L－1 salicylate on the steady-state activation curve of I Ca

鉗制電壓-50 mV，給以 -50～＋40 mV持續(xù)200 ms，階躍為10mV的一系列去極化測試脈沖，刺激頻率為0.1 Hz，可以記錄到一系列ICa。

以電流的峰值/膜電容（pA/pF）為縱坐標(biāo)，以相對應(yīng)的電壓為橫坐標(biāo)作圖，即得到ICa的電流密度-電壓曲線。Fig 2A和 Fig 2B分別顯示給藥前和給藥后的原始電流圖。Fig 2C顯示1 mmol·L-1水楊酸鈉使ICa的幅度減小，對其有抑制作用。而且，加藥前，ICa在-50 mV左右開始激活，在-30 mV到達(dá)到峰值，然后逐漸減小，到＋25 mV翻轉(zhuǎn)成外向電流。給藥后，ICa也是在-50 mV左右開始激活，在-40 mV左右達(dá)到峰值，然后逐漸減小，到＋25 mV翻轉(zhuǎn)成外向電流。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到1 mmol·L-1水楊酸鈉使ICa的I-V曲線的峰值電壓向超級(jí)化方向移動(dòng)10 mV，但是不改變其翻轉(zhuǎn)電位。

2.2 水楊酸鈉對海馬神經(jīng)元鈣電流的穩(wěn)態(tài)激活曲線的影響 鉗制電壓-50 mV，給以-50～-10 mV，持續(xù)200 ms，階躍為10 mV的一系列去極化脈沖，刺激頻率為0.1 Hz。將每次電流的峰值轉(zhuǎn)化為電導(dǎo)值，以歸一化的電導(dǎo)值為縱坐標(biāo)，相對應(yīng)的膜電位為橫坐標(biāo)，作圖。用最小二乘法，按照Boltzmann方程進(jìn)行曲線擬合。得到穩(wěn)態(tài)激活曲線（Fig 3）。在加藥前半激活電壓V1/2為（-23.52±0.50）mV，斜率k為（2.43±0.29）。給藥后半激活電壓V1/2為（-32.19±1.45）mV（P＜0.05，n＝8），斜率k為（2.30±1.31）（P＞0.05，n＝8）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1 mmol·L-1水楊酸鈉使ICa的穩(wěn)態(tài)激活曲線向超極化方向移動(dòng)大約9 mV，但是曲線的斜率并不改變。

2.3 水楊酸鈉對海馬神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)失活曲線的影響鉗制電壓 -50 mV，給以 -70～＋10 mV，持續(xù)2 000 ms，階躍為10 mV的一系列條件脈沖，然后給予去極化至＋10 mV，持續(xù)200 ms的測試脈沖，刺激頻率為0.1 Hz。以電流峰值的相對值（I／Imax）為縱坐標(biāo)，相對應(yīng)的條件脈沖為橫坐標(biāo)作圖，再利用最小二乘法，按照Boltzmann方程進(jìn)行擬合，得到ICa的穩(wěn)態(tài)失活曲線（Fig 4）。加藥前，半失活電壓 V1/2為（-23.71±1.21）mV，斜率 k為（8.35±1.14）；給藥后，半失活電壓 V1/2為（23.08±0.71）mV（P＞0.05，n＝8），斜率 k為（9.43±0.68）（P＞0.05，n＝8）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1 mmol·L-1水楊酸鈉既不使ICa的穩(wěn)態(tài)失活曲線向去極化方向移動(dòng)，也不向超極化方向移動(dòng)，也不改變其斜率。

3 討論

鈣電流是細(xì)胞動(dòng)作電位的重要電流，在形成動(dòng)作電位的平臺(tái)期方面起重要作用。VGCC開放，大量Ca2＋內(nèi)流使神經(jīng)遞質(zhì)釋放增多［13］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水楊酸鈉對ICa有抑制作用，且這種作用具有濃度依賴性。Taggart［14］在研究水楊酸鈉的安全用藥劑量時(shí)發(fā)現(xiàn)，水楊酸鈉導(dǎo)致耳鳴的發(fā)病率與水楊酸鈉的血藥濃度成正比，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與他的研究結(jié)論一致。本實(shí)驗(yàn)還顯示，1 mmol·L-1水楊酸鈉會(huì)改變ICa的激活動(dòng)力學(xué)特征，使ICa的穩(wěn)態(tài)激活曲線向超級(jí)化方向移動(dòng)大約9 mV，但是不改變其失活動(dòng)力學(xué)特征。水楊酸鈉的抑制作用可能是因?yàn)樗芘c海馬部位神經(jīng)元上的VGCC的靜息態(tài)和激活態(tài)相結(jié)合。

Brozoski等［15］用高分辨率質(zhì)子磁共振波譜技術(shù)觀察噪音導(dǎo)致耳鳴的大鼠，發(fā)現(xiàn)下丘和聽皮層的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸含量增多，而抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸含量減少。Liu等［16］利用微透析技術(shù)觀察到水楊酸鈉使豚鼠下丘和顳皮層的葡萄糖和乳酸含量增高，同時(shí)觀察到5-羥色胺含量也增高。大鼠暴露在噪音中4個(gè)月后，檢測到甘氨酸受體β亞基的含量減少［17］。我們推測興奮性氨基酸釋放的增多、抑制性氨基酸釋放的減少可能是水楊酸鈉對神經(jīng)元上各種電壓門控性離子通道的綜合作用的結(jié)果。這是因?yàn)樗鼘﹄妷洪T控性鉀通道和鈉通道的抑制會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)釋放的增多，而它對電壓門控性鈣通道的抑制會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)釋放的減少。本試驗(yàn)結(jié)果只顯示了海馬神經(jīng)元上某種離子通道的總體的變化情況，并未對神經(jīng)元進(jìn)行詳細(xì)劃分（例如分為興奮性和抑制性神經(jīng)元兩大類），所以若想弄清水楊酸鈉對神經(jīng)遞質(zhì)影響不同的確切原因，還有待于進(jìn)一步研究。

本部分實(shí)驗(yàn)利用腦片膜片鉗技術(shù)研究了水楊酸鈉對海馬部位神經(jīng)元上的VGCC的影響。水楊酸鈉抑制ICa的幅度，且這種抑制作用具有濃度依賴性，使穩(wěn)態(tài)激活曲線向超級(jí)化方向移動(dòng)，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì)減少。研究結(jié)果顯示，水楊酸鈉對海馬神經(jīng)元上的VGCC有明顯影響，這可能與耳鳴不良情緒的產(chǎn)生相關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Leaver A M，Renier L，Chevillet M A，et al.Dysregulation of limbic and auditory networks in tinnitus［J］.Neuron，2012，69（1）：33-43.

［2］ Jastreboff P J，Brennan JF，SasakiC T.An animalmodel for tinnitus［J］.Laryngoscope，1988，98（3）：280-6.

［3］ Bauer C A，Brozoski T J，Rojas P，et al.Behavioral model of chronic tinnitus in rats［J］.Otolarygol Head Neck Surg，1999，121（4）：457-62.

［4］ Rüttiger J，Jürgen C，Hans-Peter Z，et al.A behavioral paradigm to judge acute sodium salicylate-induced sound experience in rats：a new approach for an animalmodel on tinnitus［J］.Hear Res，2003，180（1-2）：39-50.

［5］ 劉硯星，李學(xué)佩，張海林，等.水楊酸鈉對大鼠顳皮層神經(jīng)元延遲整流鉀通道的抑制作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2011，27（4）：482-6.

［5］ Liu Y X，Li X P，Zhang H L，et al.Inhibition of sodium salicylate on delayed rectifier potassium channels in rat auditory cortex neurons？［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27（4）：482-6.

［6］ Dobie R A.Depression and tinnitus［J］.Otolaryngol Clin North Am，2003，36（2）：383-8.

［7］ Langguth B，Landgrebe M，Kleinjung T，et al.Tinnitus and de-pression［J］.World JBiol Psychiatry，2009，12（7）：489-500.

［8］ Robinson SK，Viirre E S，Bailey K A，et al.A randomized controlled trial of cognitive-behavior therapy for tinnitus［J］.Int Tinnitus J，2008，14（2）：119-26.

［9］ McCullough L D，Sokolowski JD，Salamone JD.A neurochemical and behavioral investigation of the involvement of nucleus accumbens dopamine in instrumental avoidance［J］.Neuroscience，1993，52（4）：919-25.

［10］Mirz F，Gjedde A，Ishizu K，et al.Cortica l networks subserving the perception of tinnitus-a PET study［J］.Acta Otolaryngol Suppl，2000，543（2）：241-3.

［11］Mirz F，Gjedde A，Sodkilde-Jrgensen H，et al.Functional brain imaging of tinnitus-like perception induced by aversive auditory stimuli［J］.Neuroreport，2000，11（3）：633-7.

［12］Lockwood A H，SalviR J，Coad M L，etal.The functional neuroanatomy of tinnitus：evidence for limbic system links and neural plasticity［J］.Neurology，1998，50（1）：114-20.

［13］Takahashi K，WakamoriM，Akaike N.Hippocampal CA1 pyramidal cells of rats have four voltage-dependent calcium conductances［J］.Neurosci Lett，1989，104（1-2）：229-34.

［14］Taggart A J.Symptomatic salicylate ototoxicity：a useful indicator of serum salicylate concentration［J］？Ann Rheum Dis，1992，51（5）：704.

［15］Brozoski T，Odintsov B，Bauer C.Gamma-aminobutyric acid and glutamic acid levels in the auditory pathway of rats with chronic tinnitus：a direct determination using high resolution point-resolved proton magnetic resonance spectroscopy（H-MRS）［J］.Front Syst Neurosci，2012，6：9.

［16］Liu J，Li X.Effect of acute salicylate on 5-HTergic activity in the inferior colliculus and the auditory cortex of rat［J］.Hear Res，2003，175（1-2）：45-53.

［17］Wang H，Turner JG，Brozoski T J.Plasticity at glycinergic synapses in dorsal cochlear nucleus（DCN）of rats with behavioral evidence of tinnitus［J］.Neuroscience，2009，164（2）：747-59.