宋新文，汪洋，劉炘，彭靜，許瓊

(武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心，武漢 430016)

固相萃取高效液相色譜法測(cè)定全血環(huán)孢素濃度

宋新文，汪洋，劉炘，彭靜，許瓊

(武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心，武漢 430016)

目的 建立一種簡(jiǎn)便的測(cè)定全血環(huán)孢素濃度的高效液相色譜法。方法以Venusil ASB C18為色譜柱,流動(dòng)相為乙腈-水=70∶30,柱溫70℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm,進(jìn)樣量200μL;全血樣品經(jīng)10%尿素溶血處理離心后,取上清液直接上PRS-SPE柱,用等體積乙腈-四氫呋喃(80∶20)作為洗脫劑,收集洗脫液直接進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果環(huán)孢素全血樣品線性范圍為30～3 500 ng·mL-1,低、中、高3種不同濃度(78.2,300.0,1 213.0 ng·mL-1)方法回收率分別為101.66%,104.06%,100.46%,日內(nèi)、日間RSD均<5%。結(jié)論該方法準(zhǔn)確性好,靈敏度高,樣品處理簡(jiǎn)單,可滿足兒科臨床中環(huán)孢素全血濃度監(jiān)測(cè)需要。

環(huán)孢素；固相萃?。簧V法,高效液相

環(huán)孢素是臨床上常用的免疫抑制藥,在成人主要用于器官移植后抗免疫排斥,在兒科臨床上多用于重型再生障礙性貧血和難治性腎病綜合征的治療,也可用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、噬血細(xì)胞綜合征等其他免疫性疾病。但是環(huán)孢素毒副作用大,治療窗較窄,藥物吸收個(gè)體差異大,臨床上往往需要通過(guò)監(jiān)測(cè)其血藥濃度來(lái)實(shí)行個(gè)體化用藥,以減少其肝、腎毒性等不良反應(yīng)和提高治療效果。因此,開(kāi)發(fā)和建立一種能夠快速、準(zhǔn)確地測(cè)定血液中環(huán)孢素濃度的檢測(cè)技術(shù)以指導(dǎo)安全合理使用環(huán)孢素就具有十分重要的臨床價(jià)值。

目前國(guó)內(nèi)外測(cè)定環(huán)孢素血藥濃度的方法主要有熒光偏振免疫法和高效液相色譜法(HPLC)［1］。熒光偏振免疫法簡(jiǎn)便、快速、靈敏,但其測(cè)定成本昂貴(需要依賴專用試劑),且該法易受代謝產(chǎn)物因素的干擾而使測(cè)定結(jié)果誤差較大。HPLC法具有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、成本低廉、易于推廣普及等優(yōu)點(diǎn),但文獻(xiàn)報(bào)道［2～4］大多采用液液萃取法等多重步驟提取,操作比較復(fù)雜,難以適應(yīng)臨床常規(guī)監(jiān)測(cè)的需要。為此筆者通過(guò)固相萃取處理樣品建立了HPLC法測(cè)定全血環(huán)孢素,用于小兒再生障礙性貧血及激素耐藥型腎病綜合征(難治性腎病)患兒環(huán)孢素全血濃度的監(jiān)測(cè),取得了滿意效果,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀:包括G1311C二元色譜泵、G1316A柱恒溫箱、G1315D二極管陣列紫外檢測(cè)器(DAD)、Agilent1260化學(xué)工作站；WH-1微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；LDZ4-0.8A臺(tái)式離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；AB204萬(wàn)分之一電子分析天平(瑞士產(chǎn))；Cleanert PRS丙磺酸強(qiáng)陽(yáng)離子交換固相萃取柱(規(guī)格:每支200 mg；Agela Technologies公司生產(chǎn))。

1.2 試藥 環(huán)孢素對(duì)照品(上海梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司,批號(hào):K4J6E-DA)；乙腈(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20120629,色譜純)；正?？瞻兹?實(shí)驗(yàn)室自制)；0.9%氯化鈉注射液(武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司,批號(hào):120704-201)；尿素(天津鴻鑫化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20110803),四氫呋喃(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所,批號(hào):20120305)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Venusil ASB C18(4.6 mm× 200 mm,10μm)；流動(dòng)相為乙腈∶水=70∶30；流速0.8 mL·min-1；柱溫70℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；進(jìn)樣量200μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取環(huán)孢素對(duì)照品3.832 mg,用70%乙腈定容于10 m L量瓶,再取1 mL用70%乙腈定容于10 mL量瓶中,得到濃度為38.32μg·mL-1的對(duì)照液,作為①號(hào)對(duì)照液,然后按照倍比稀釋原則依次稀釋到⑧號(hào),①～⑧號(hào)對(duì)照液濃度分別為38.32,19.16,9.58,4.79,2.40,1.20,0.60, 0.30μg·mL-1。

2.3 全血標(biāo)本的處理 取全血樣品0.5 mL,加入10%尿素溶液1 mL,混合均勻,經(jīng)12 000 r·min-1離心10 min,吸取上清液于PRS固相萃取小柱,待其自然瀝干后加入0.9%氯化鈉注射液3 mL進(jìn)行淋洗,將固相萃取小柱于4 000 r·min-1離心2 min,最后用洗脫液(乙腈∶四氫呋喃=80∶20)0.5 m L上柱洗脫,收集洗脫液,取200μL進(jìn)樣測(cè)定。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)品和全血標(biāo)本色譜圖 分別取空白全血樣品、含環(huán)孢素全血樣品及環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖。結(jié)果環(huán)孢素色譜峰與全血中內(nèi)源性雜質(zhì)峰能夠很好分離,無(wú)干擾峰出現(xiàn),環(huán)孢素的保留時(shí)間約13 min,環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)品、空白全血、含環(huán)孢素樣品及色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 3種樣品的HPLC圖A.空白全血;B.環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)液;C.含環(huán)孢素全血樣品; 1.環(huán)孢素Fig.1 HPLC chromatogram of 3 kinds of sam p lesA.blank whole blood;B.cyclosporine standard solution; C.whole blood sample containing cyclosporine;1.cyclosporine

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 依次量取上述①～⑧對(duì)照液各0.1 mL加入到空白全血1 m L中,漩渦混合均勻,可得濃度依次為27.27,54.54,109.10,218.20,435.50, 870.70,1 741.80,3 483.60 ng·mL-1的工作全血標(biāo)本,分別取0.5 mL按“2.3全血標(biāo)本的處理”項(xiàng)下進(jìn)行處理,記錄色譜峰面積,以峰面積A為橫坐標(biāo),以對(duì)照液濃度(C)為縱坐標(biāo),得直線回歸方程為C=A×3.1-0.5,r=0.999 9,最低檢測(cè)濃度為27 ng·mL-1

2.6 回收率及精密度實(shí)驗(yàn) 分別配制低(78.2 ng·m L-1)、中(300.0 ng·m L-1)、高(1 213 ng·m L-1)3種不同濃度的環(huán)孢素全血樣品,每種濃度的樣品各取3份,照“2.3”項(xiàng)下操作,記錄色譜峰面積,如此連續(xù)操作3 d,根據(jù)工作標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別計(jì)算日內(nèi)回收率及日間回收率,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 環(huán)孢素回收率和精密度測(cè)定結(jié)果Tab.1 Recovery and precision results of cyclosporine %

2.7 臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果 32例次難治性腎病患兒及10例次再生障礙性貧血患兒,按4～8 mg·kg-1·d-1、每12 h 1次口服環(huán)孢素口服溶液,分別取服藥前全血樣本(谷濃度)及服藥2 h后全血樣本(峰濃度)測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Determination results of clinical specimens ng·mL-1,±s

表2 臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Determination results of clinical specimens ng·mL-1,±s

項(xiàng)目例次谷濃度峰濃度難治性腎病32 71.6±41.7 559.8±143.3再生障礙性貧血10 155.5±66.4 1 125.0±343.1

3 討論

3.1 色譜條件的確立 環(huán)孢素是一種內(nèi)含11個(gè)氨基酸的環(huán)狀多肽化合物,紫外吸收較弱,文獻(xiàn)［2～6］均以210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng),故本實(shí)驗(yàn)也采用此波長(zhǎng)。

由于環(huán)孢素相對(duì)分子質(zhì)量大,脂溶性高,采用C18反相色譜柱分離時(shí)需用較高的柱溫才能使其有效分離,否則峰形很寬,呈丘陵?duì)?。本?shí)驗(yàn)分別嘗試50, 55,60,65,70℃柱溫,發(fā)現(xiàn)隨著柱溫升高,峰寬逐步減小,峰形改善明顯,考慮到柱溫太高會(huì)影響色譜柱壽命,故最終確定柱溫為70℃。本研究使用的天津博納艾杰爾公司生產(chǎn)的Venusil ASB C18色譜柱,在80℃柱溫條件下可以連續(xù)使用100 h,故在70℃條件下間斷運(yùn)行是完全可行的。

環(huán)孢素在全血中的濃度較低,在激素耐藥型腎病綜合征(難治性腎病)患兒其有效谷濃度一般維持為100～200 ng·mL-1［7］,而在再生障礙性貧血患兒有效谷濃度為200～400 ng·mL-1［8］,因此,提高全血中環(huán)孢素的最低檢測(cè)限尤為關(guān)鍵。文獻(xiàn)大多采用將全血標(biāo)本提取后濃縮5～10倍,以提高進(jìn)針樣品中環(huán)孢素的濃度的辦法,而儀器進(jìn)樣量仍采用通常體積20μL［2～6］。本研究在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也曾采用過(guò)此類方法,但結(jié)果仍不理想,主要是存在最低檢測(cè)限仍然不能滿足兒科臨床實(shí)際標(biāo)本需要的缺點(diǎn)。受文獻(xiàn)［9］啟發(fā),實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用全血標(biāo)本等體積提取(0.5→0.5 m L),200μL大體積進(jìn)樣,結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以克服上述不足,最低檢測(cè)限可達(dá)27 ng·mL-1,故確定進(jìn)樣量為200μL。

3.2 全血中紅細(xì)胞膜處理 環(huán)孢素在血液中41%～58%分布在紅細(xì)胞中［1］,所以測(cè)定全血中環(huán)孢素的濃度時(shí)需要對(duì)全血樣品進(jìn)行溶血預(yù)處理,一般采用氫氧化鈉、氟化鈉或十二烷基硫酸鈉破壞紅細(xì)胞,以保證有機(jī)溶劑對(duì)環(huán)孢素的萃取率［10］。尿素分子能夠自由進(jìn)入到紅細(xì)胞內(nèi),利用滲透壓原理,本實(shí)驗(yàn)采用10%尿素溶液加入到全血標(biāo)本中以破壞紅細(xì)胞,高速離心后可見(jiàn)管底有一薄層膜狀物,吸取上清液上固相萃取柱,過(guò)柱速度基本令人滿意。

3.3 固相萃取小柱的選擇 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分別嘗試用C8柱、C18柱、氨基柱、氰基柱、羧基柱等不同填料的固相萃取小柱,以甲醇或乙腈作為洗脫劑,結(jié)果均不滿意,內(nèi)源性雜質(zhì)較多,不能與環(huán)孢素達(dá)到有效分離。采用丙磺酸強(qiáng)陽(yáng)離子型(PRS)固相萃取小柱,以“乙腈∶四氫呋喃=80∶20”作為洗脫劑,在環(huán)孢素色譜峰附近基本無(wú)內(nèi)源性雜質(zhì)干擾,故確定PRS小柱為環(huán)孢素全血標(biāo)本處理固相萃取柱。

本研究建立的環(huán)孢素全血濃度測(cè)定方法,樣品處理簡(jiǎn)單,準(zhǔn)確度高,特異性好,用于兒科難治性腎病及再生障礙性貧血環(huán)孢素血藥濃度監(jiān)測(cè),結(jié)果令人滿意,值得推廣。

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DOI 10.3870/yydb.2014.01.009

Determination of Cyclosporin in Whole Blood by Solid-Phase Extraction and High Perform ance Liquid Chromatography

SONG Xin-wen,WANG Yang,LIU Xin,PENG Jing,XU Qiong
(Women and Children Health Care Center in Wuhan City,Wuhan 430016,China)

Objective To establish a simple high-performance liquid chromatography(HPLC)method to determinate cyclosporin in whole blood.MethodsThe HPLC was carried out by using Venusil ASB C18column,acetonitrile/water(70∶30)as a mobile phase,setting column temperature at 70℃,detection wavelength at 210 nm.Whole blood samples were centrifugated after treated with 10%urea for hemolysis.Two hundred microliters of the supernatantwas directly injected into the PRS-SPE column,using equal volume of acetonitrile/tetrahydrofuran(80∶20)as the eluent.ResultsThemethod is linear at 30 to 3 500 ng·mL-1curve range.The recoveries at low,medium and high concentrations(78.2,300.0,1 213.0 ng· mL-1)were 101.66%,104.06%and 100.46%,respectively.The intra-and inter-day RSD were less than 5%.ConclusionThemethod isaccurate,sensitive,and the sample iseasy to handle,fullymeeting the requirementof pediatric clinical practice for determination of cyclosporin in whole blood.

Cyclosporin;Solid phase extraction;Chromatography,high performance liquid

R979.5;R969

A

1004-0781(2014)01-0031-03

2013-03-18

2013-05-06

宋新文(1968-),男,湖北武漢人,副主任藥師,研究方向:治療藥物監(jiān)測(cè)及兒科臨床藥學(xué)。電話：(0) 13797028603,E-mail：13797028603@126.com。