邱楠楠，劉金平，盧丹，李平亞

(吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，長春 130021)

紫紅參提取物灌胃給予大鼠后入血成分研究*

邱楠楠，劉金平，盧丹，李平亞

(吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，長春 130021)

目的 分析紫紅參提取物入血成分,探討紫紅參提取物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。方法對(duì)大鼠灌胃給予紫紅參提取物后,收集血清樣品,采用超高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-ESI-MS/MS)法,鑒定灌胃紫紅參后大鼠血清中的移行成分。結(jié)果大鼠含藥血清中檢測(cè)到了14種入血成分,其中6種為紫紅參提取物中原型吸收入血的成分,其余入血成分可能為代謝產(chǎn)物或機(jī)體吸收紫紅參后產(chǎn)生的應(yīng)激性成分。結(jié)論紫紅參14種入血成分可能是其體內(nèi)直接作用物質(zhì),對(duì)其進(jìn)行深入研究將有助于揭示紫紅參的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥效機(jī)制。

紫紅參；藥效成分；藥物化學(xué)

人參(Panaχ ginsengC.A.Mey)為五加科人參屬多年生宿根草本植物,其性溫、味甘,具有大補(bǔ)元?dú)?、?qiáng)心固脫、安神生津等功效,被譽(yù)為“百草之王”,具有很高的藥用價(jià)值?，F(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)研究表明,人參具有提高機(jī)體免疫力［1］、抗抑郁［2］、抗疲勞［3-4］、抗腫瘤［5］、抗血栓［6］、抗炎［7］以及改善記憶力［8］等多種活性。紫紅參(又稱活性人參)是將人參反復(fù)蒸制烘干而得到的一種人參深加工產(chǎn)品。在將人參炮制加工成紫紅參的過程中,部分化學(xué)成分會(huì)發(fā)生變化,產(chǎn)生一些稀有皂苷(元)。對(duì)紫紅參的藥理活性研究表明,紫紅參具有抗腫瘤［9］、壯陽等活性作用。筆者采用超高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用(ultra-performance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry, UPLC-ESI-MS/MS)法對(duì)紫紅參的血清藥物化學(xué)進(jìn)行了初步研究,通過檢測(cè)紫紅參的入血成分來確定其藥效物質(zhì)基礎(chǔ),為進(jìn)一步研究紫紅參的作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 Wistar大鼠,雄性,體質(zhì)量210～250 g,由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供,質(zhì)量合格證號(hào):醫(yī)動(dòng)字第10-5110號(hào)。

1.2 藥品及試劑 紫紅參(吉林省皇封參集團(tuán)股份有限公司,批號(hào):100116)；乙腈、甲酸均為色譜純(德國Fisher公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純(北京化工廠)。

1.3 儀器 Waters Xevo TQ-S液質(zhì)聯(lián)用色譜儀(美國Waters公司)；N110 dR型氮?dú)獍l(fā)生器；SHB-Ⅲ型循環(huán)水多用真空泵；KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DCY-12S型氮吹儀(青島?？苾x器有限公司)；FA11O4N型電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；RCT-3200型超純水儀(長春博萊帕特科技發(fā)展有限公司)；飛鴿超離速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.4 色譜與質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1mm×50mm,1.7μm)色譜柱；柱溫:30℃；樣品管理器溫度:15℃；流速:0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量: 4μL；流動(dòng)相A(0.1%甲酸)-B(乙腈),梯度洗脫,洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子化源(ESI),負(fù)離子檢測(cè)模式。掃描范圍:m/z 100～1 500。毛細(xì)管電壓: 3.0 kV；錐孔電壓:40 V；源溫度:150℃；脫溶劑氣溫度:400℃；錐孔氣流量:150 L·h-1；脫溶劑氣流量: 800 L·h-1；氬氣流量:0.15 mL·min-1。

1.5 紫紅參提取物及灌胃藥液的制備

1.5.1 紫紅參提取物及其供試品溶液的制備 稱取紫紅參1 kg,用70%乙醇加熱回流提取3次,每次3 h,合并提取液,減壓濃縮至無醇味,經(jīng)真空干燥后得其粉末。取紫紅參粉末(過孔徑250μm篩)0.5 g,精密稱定,精密加入甲醇25 mL,稱定質(zhì)量,密塞,超聲處理(功率100 W,頻率40 kHz)45 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,過孔徑0.22μm微孔濾膜,取續(xù)濾液,即得。

1.5.2 灌胃藥液的制備 取紫紅參提取物粉末,加水溶解,使配制成溶液濃度分別為26.4,52.8,66.0, 132.0 mg·mL-1

1.6 入血成分分析的前期條件優(yōu)化

1.6.1 給藥劑量的確定取10只大鼠,分為空白組2只,給藥組8只。大鼠于實(shí)驗(yàn)前禁食12 h,自由飲水?？瞻捉M給予0.9%氯化鈉溶液,給藥組選擇4個(gè)劑量給藥,分別為0.30,0.60,0.75,1.50 g·kg-1,每個(gè)劑量2只大鼠。灌胃4 h后,用乙醚將大鼠麻醉,麻醉后腹主靜脈取血。置于10 mL EP管中,靜置60 min后,以4 000 r·min-1離心20 min,取上清液。取0.1 mL上清液加入4倍體積的甲醇沉淀后,渦旋混勻3 min,將混合液在4 000 r·min-1下離心20 min,除去蛋白質(zhì),吸取上清液,氮?dú)獯蹈?。所得殘?jiān)眉状?.1 mL復(fù)溶,過孔徑0.22μm微孔濾膜,即得,進(jìn)樣分析。結(jié)果表明,當(dāng)給藥劑量為1.50 g·kg-1時(shí),總離子流色譜圖效果最好,入血成分峰最多,且峰面積增加,適合對(duì)入血成分進(jìn)行分析。因此,確定大鼠灌胃給藥的最佳劑量為1.50 g·kg-1。

1.6.2 取血時(shí)間的篩選 將供試的4只大鼠隨機(jī)分為空白組和給藥組。給藥組以1.50 g·kg-1大鼠體質(zhì)量的劑量對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃,空白組給予同體積0.9%氯化鈉溶液。給藥前禁食12 h,自由飲水。分別于給藥后1,2,3,4,5 h用乙醚將大鼠麻醉,眼眶靜脈竇取血0.5 mL,分別滴置于離心管中。血樣處理方法同上。結(jié)果表明,當(dāng)取血時(shí)間為給藥后4 h,入血成分譜中峰的個(gè)數(shù)最多,且峰強(qiáng)度最好,適宜做進(jìn)一步分析。

2 結(jié)果

2.1 紫紅參的正、負(fù)離子檢測(cè)模式總離子流圖 采集紫紅參提取物的正、負(fù)離子模式下的離子流色譜圖,見圖1,2。

2.2 大鼠血清色譜圖的建立 選擇大鼠給藥劑量為1.50 g·kg-1,取血時(shí)間為給藥后4 h,收集血清樣品,分別采集正、負(fù)離子模式下的離子流色譜圖,見圖3, 4。

2.3 入血成分的鑒定

2.3.1 原型化合物的鑒定 對(duì)比觀察給藥后血清和空白血清的離子流色譜圖,發(fā)現(xiàn)將血清中的內(nèi)源性成分扣除掉以后,紫紅參入血成分的負(fù)離子檢測(cè)模式總離子流圖中,含藥血清比空白血清多了10個(gè)色譜峰；紫紅參入血成分的正離子檢測(cè)模式總離子流圖中,含藥血清比空白血清多了4個(gè)色譜峰?；衔飻?shù)據(jù)見表2。將這14個(gè)色譜峰和紫紅參提取物的譜圖進(jìn)行對(duì)照,發(fā)現(xiàn)其中的6個(gè)峰也存在于紫紅參提取物中,因此可以推測(cè)這6個(gè)成分為原型入血成分。

圖1 紫紅參的正離子檢測(cè)模式總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of purplish red ginseng by mass spectrometry(ESI+)

圖2 紫紅參的負(fù)離子檢測(cè)模式總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of purplish red ginseng by mass spectrometry(ESI-)

圖3 空白血清和紫紅參入血成分的負(fù)離子檢測(cè)模式總離子流圖A.空白血清;B.紫紅參Fig.3 Total ion chromatogram of blank serum and com ponents of purp lish red ginseng absorded into blood by mass spectrometry(ESI-)A.blank serum;B.purplish red ginseng

圖4 空白血清和紫紅參入血成分的正離子檢測(cè)模式總離子流圖A.空白血清;B.紫紅參Fig.4 Total ion chromatogram of blank serum com ponents of purp lish red ginseng absorded into blood by mass spectrometric(ESI+)A.blank serum;B.purplish red ginseng

表2 紫紅參入血成分的UPLC-ESI-MS/MS鑒定結(jié)果Tab.2 UPLC-ESI-M S/MS identification results on components of purplish red ginseng absorded into blood

2.3.2 代謝產(chǎn)物的鑒定 化合物M5:m/z603.4［MH］-,對(duì)比保留時(shí)間,初步確定其為人參皂苷Rg5/Rk1在體內(nèi)失去一分子葡萄糖的降解產(chǎn)物。

3 討論

皂苷類藥物口服吸收率低,入血含量微少,以往常采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法和反相高效液相色譜法對(duì)入血成分進(jìn)行檢測(cè),但靈敏度都不如UPLCESI-MS/MS法,而且前兩者進(jìn)行定性分析時(shí)需要對(duì)照品,而本實(shí)驗(yàn)采用的UPLC-ESI-MS/MS法具有高效能、高靈敏度、高專屬性,并且能通過相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行定性分析。

筆者通過優(yōu)化紫紅參的給藥劑量和取血時(shí)間條件,建立了紫紅參血清藥物化學(xué)的分析方法。采用UPLC-ESI-MS/MS方法對(duì)紫紅參提取物給藥血清和空白血清進(jìn)行了對(duì)比分析,從大鼠含藥血清中共檢測(cè)到14種入血成分。包括:電噴霧離子化源(ESI),負(fù)離子檢測(cè)模式下檢測(cè)出10種成分(表2),根據(jù)UPLC-ESIMS/MS結(jié)果結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道,鑒定了其中3種化學(xué)成分,分別為20(S)-原人參皂苷Rg3、姜狀三七苷R1、人參皂苷M5。其中,20(S)-原人參皂苷Rg3和姜狀三七苷R1為原型藥物。人參皂苷M5為代謝產(chǎn)物,結(jié)合紫紅參提取物的UPLC-ESI-MS/MS圖譜和該成分的分子結(jié)構(gòu),判斷其為人參皂苷Rg5/Rk1在體內(nèi)的降解產(chǎn)物。另在大鼠含藥血清中未檢測(cè)出紫紅參提取物中含量較高的人參皂苷Ro成分,但檢測(cè)出姜狀三七苷R1,結(jié)合二者的分子結(jié)構(gòu),故推斷人參皂苷Ro在體內(nèi)可能以其降解產(chǎn)物——姜狀三七苷R1形式被吸收入血。

電噴霧離子化源(ESI),正離子檢測(cè)模式下檢測(cè)出4種成分(表2),根據(jù)UPLC-ESI-MS/MS結(jié)果結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道,鑒定了其結(jié)構(gòu),分別為20(S)-原人參三醇、20 (R)-原人參三醇、20(S)-原人參二醇和20(R)-原人參二醇,均為原型藥物。

大鼠含藥血清中還檢測(cè)到其余7種入血成分,可能是紫紅參提取物在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化或機(jī)體灌服吸收紫紅參后產(chǎn)生的應(yīng)激性成分。

綜上所述,采用血清藥物化學(xué)的研究方法,對(duì)紫紅參的入血成分進(jìn)行了研究,明確了紫紅參提取物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),為其在臨床上的廣泛應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

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DOI 10.3870/yydb.2014.01.005

Com ponents Study in Rat Blood After Oral Adm inistration of Extracts from Purplish Red Ginseng

QIU Nan-nan,LIU Jin-ping,LU Dan,LI Ping-ya
(Institute of Frontier Medical Science of Jilin University, Changchun 130021,China)

Objective To analyze components absorbed in the blood of extracts from purplish red ginseng and illustrate its effective substance.MethodsThe serum sample was collected after oral administration of the extract of purplish red ginseng in rats,and the shift componentswere identified by UPLC-ESI-MS/MS.ResultsFourteen transitional components in rat′s serum were detected,six were constituents absorbed in blood in prototype of extracts and the othersmight be irritability compositions ormetabolites of purplish red ginseng in blood.ConclusionThe fourteen constituents absorbed into blood may be the bioactive components that act directly on the body,laying a foundation for studing active components and therapeutic mechanism of purplish red ginseng.

Purplish red ginseng;Ingredient;Pharmacochemistry

R284;R285.5

A

1004-0781(2014)01-0016-04

2013-02-18

2013-06-21

*吉林省科技廳重大項(xiàng)目(20096039)

邱楠楠(1985-),女,遼寧昌圖人,博士,研究方向:天然藥物化學(xué)成分及其生物活性研究。電話：(0) 13943007632,E-mail：qiunn10@mails.jlu.edu.cn。

李平亞(1957-),男,吉林公主嶺人,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向:天然藥物化學(xué)成分及其生物活性研究。電話：0431-85619803,E-mail：lipy@jlu.edu.cn。