秦福芳，孫倩，邵鳳民

(1.鄭州人民醫(yī)院特需科，鄭州 450003；2.河南省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，鄭州 450003)

咪唑立賓對(duì)急性Thy1腎炎大鼠系膜細(xì)胞p27的影響*

秦福芳1，孫倩1，邵鳳民2

(1.鄭州人民醫(yī)院特需科，鄭州 450003；2.河南省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，鄭州 450003)

目的 觀察咪唑立賓對(duì)急性Thy1腎炎大鼠系膜細(xì)胞p27的影響。方法雄性SD大鼠90只,分為5組:正常組、模型組、咪唑立賓組、咪唑立賓+氯沙坦組、氯沙坦組,正常組10只,其余各組每組20只。腎炎誘導(dǎo)后第1,3,5,7天取腎臟組織;過(guò)碘酸希夫(PAS)染色評(píng)估系膜細(xì)胞增殖;逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)p27基因表達(dá)水平;免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)p27蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與正常組比較,模型組系膜細(xì)胞明顯增殖,p27蛋白表達(dá)水平顯著減少(P<0.05);與模型組比較,3個(gè)治療組的系膜細(xì)胞增殖程度明顯減輕(P<0.05),p27蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05);咪唑立賓或咪唑立賓聯(lián)合氯沙坦的治療作用顯著優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用氯沙坦(P<0.05)。結(jié)論咪唑立賓與氯沙坦均可抑制系膜細(xì)胞增殖,且咪唑立賓的作用較氯沙坦強(qiáng),咪唑立賓能夠通過(guò)上調(diào)p27蛋白表達(dá),從而抑制系膜細(xì)胞增殖。

咪唑立賓；Thy1腎炎；系膜細(xì)胞；p27

臨床上許多腎小球疾病的病理特征均表現(xiàn)為系膜細(xì)胞增殖,因此研究如何抑制系膜細(xì)胞增殖具有重要意義。咪唑立賓(mizoribine,MZ)是一種免疫抑制藥,對(duì)異常增殖的細(xì)胞及各種有絲分裂素引起的細(xì)胞分裂具有抑制作用［1］。研究表明咪唑立賓能抑制系膜細(xì)胞增殖［2］,p27與系膜細(xì)胞增殖成負(fù)相關(guān)［3］；咪唑立賓抑制系膜細(xì)胞增殖是否與p27有關(guān)？筆者尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道,故在本實(shí)驗(yàn)中制備了急性Thy1腎炎動(dòng)物模型［4］,觀察咪唑立賓對(duì)系膜細(xì)胞p27的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性Wistar大鼠,購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,體質(zhì)量:140～160 g；OX-7單克隆抗體(解放軍總醫(yī)院腎臟病研究所惠贈(zèng))；咪唑立賓(日本旭化成制藥株式會(huì)社提供,批號(hào):H2010122),氯沙坦(杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào):09022)；大鼠抗小鼠p27單克隆抗體(sc-10621)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG(AP021)。引物序列:上游5′-GCA GCT TGC CCG AGT TCT AC-3′,下游5′-TTC TTG GGCGTC TGC TCC AC-3′。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與動(dòng)物模型制備 雄性Wistar大鼠90只,隨機(jī)分為5組:正常組(10只)、模型組(20只)、咪唑立賓組(20只)、咪唑立賓+氯沙坦組(20只)、氯沙坦組(20只)。模型組與治療組給予尾靜脈注射OX-7單克隆抗體(100 mg·kg-1)；正常組注射等量0.9%氯化鈉注射液。注射后6 h開(kāi)始灌胃給藥,連續(xù)給藥7 d。具體組別及給藥方案如下,正常組:純化水；模型組:純化水；咪唑立賓組:咪唑立賓(20 mg·kg-1)；氯沙坦組:氯沙坦(200 mg·kg-1)；咪唑立賓+氯沙坦組:咪唑立賓(20 mg·kg-1)+氯沙坦(200 mg·kg-1)。病理檢查結(jié)果顯示:系膜細(xì)胞重度增殖,表明造模成功［4］。

1.3 標(biāo)本留取 各組大鼠于腎炎誘導(dǎo)后第1,3,5,7天各時(shí)間點(diǎn)取腎組織。所取腎組織分別用于過(guò)碘酸希夫(periodic acid schiff,PAS)染色、直接免疫熒光檢測(cè)、RNA、蛋白質(zhì)提取及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)、Western blot等分析。

1.4 腎臟常規(guī)病理 采用PAS染色,光鏡觀察,對(duì)腎小球內(nèi)有核細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù),每個(gè)標(biāo)本400倍光鏡下觀察100個(gè)腎小球。免疫熒光檢測(cè)p27陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.5 RT-PCR檢測(cè)p27mRNA水平 按Trizol試劑盒說(shuō)明書一步法提取腎組織總RNA,取總RNA 10μg逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,取cDNA1μL擴(kuò)增p27的基因片段。PCR總反應(yīng)體系25μL,含cDNA模板1μL,10×Buffer 2.5μL,2.5 mmol dNTP 1.5μL,25 mmol·L-1氯化鎂(MgCl2)2.0μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,上游及下游引物各0.25μL,加去離子消毒水補(bǔ)至25μL。擴(kuò)增條件p27:95℃變性45 s,62℃退火45 s,72℃7 min延伸,28個(gè)循環(huán)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH):95℃變性45 s, 58℃退火45 s,72℃7 min延伸,26個(gè)循環(huán)。置于1.2%瓊酯糖凝膠,電泳。以GAPDH為內(nèi)參照。采用GDS8000凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描分析,計(jì)算p27的mRNA及GAPDH-mRNA的比值。

1.6 Western blot檢測(cè)p27的蛋白水平 提取腎組織總蛋白質(zhì):將凍存腎組織100 mg加入預(yù)冷的組織細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑,勻漿,冰浴1 h,分裝于EP管各約500μL,12 000 r·min-1(r=8 cm)離心15 min, 4℃,取中間層液體,即為所提蛋白。取蛋白100μg上樣；進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳,半干法轉(zhuǎn)移至聚氟乙烯膜上,加入小鼠p27單克隆抗體(1∶200),4℃過(guò)夜。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG (1∶2 000)作為二抗,室溫?fù)u床1 h。電化學(xué)發(fā)光法顯影。β-actin作為內(nèi)參照,采用Alphaimager 2200凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 正常組、模型組及氯沙坦組大鼠均無(wú)明顯異常,體質(zhì)量逐漸增加。咪唑立賓組及咪唑立賓+氯沙坦組體質(zhì)量增長(zhǎng)稍緩慢,但與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠腎臟病理分析結(jié)果 正常組、模型組、咪唑立賓組、氯沙坦組和咪唑立賓+氯沙坦組大鼠腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞數(shù)分別為(70±8),(130±10),(89± 9),(101±7),(93±8)個(gè)。與正常組比較,模型組第4至6天系膜細(xì)胞明顯增殖(t=16.48,P<0.01)。咪唑立賓組及氯沙坦組系膜細(xì)胞增殖顯著減少(P<0.05)。

2.3 p27mRNA的表達(dá) 第3天,各組大鼠之間p27mRNA的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 5組大鼠第3天p27mRNA表達(dá)A.正常組;B.模型組;C.咪唑立賓組;D.咪唑立賓+氯沙坦組;E.氯沙坦組Fig.1 p27m RNA expression on the third day in five groups of ratsA.normal group;B.model group;C.mizoribine group;D. m izoribine plus losartan group;E.losartan group

2.4 p27蛋白的表達(dá) 第3天,與正常組比較,模型組p27蛋白表達(dá)顯著減少(t=2.47,P<0.05)；與模型組比較,咪唑立賓組、咪唑立賓+氯沙坦組及氯沙坦組p27蛋白表達(dá)顯著增加(t=10.8,t=6.32 t=4.62,P< 0.05)。見(jiàn)圖2。

2.5 各組大鼠p27陽(yáng)性細(xì)胞免疫熒光染色 第3天,與正常組比較,模型組p27陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少(t= 2.57,P<0.05)；與模型組比較,咪唑立賓組、氯沙坦組、咪唑立賓+氯沙坦組p27陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加(P< 0.05)。見(jiàn)圖3。

3 討論

咪唑立賓是一種免疫抑制藥,競(jìng)爭(zhēng)性抑制嘌呤合成系統(tǒng)中的肌苷酸至鳥(niǎo)苷酸途徑,能夠抑制各種分裂素引起的細(xì)胞分裂［1］。體外研究發(fā)現(xiàn)咪唑立賓能夠抑制系膜細(xì)胞增殖［5］。氯沙坦是一種血管緊張肽Ⅱ受體拮抗藥,它對(duì)系膜細(xì)胞增殖的抑制作用已經(jīng)得到公認(rèn),并被應(yīng)用于系膜增生性腎小球腎炎［6-7］。故本實(shí)驗(yàn)將氯沙坦作為陽(yáng)性對(duì)照藥。觀察咪唑立賓對(duì)急性Thy1腎炎大鼠系膜細(xì)胞增殖的影響。

圖2 5組大鼠第3天腎組織內(nèi)p27蛋白表達(dá)A.正常組;B.模型組;C.咪唑立賓組;D.咪唑立賓+氯沙坦組;E.氯沙坦組;與正常組比較,*1P<0.05;與模型組比較,*2P<0.05Fig.2 p27m RNA expression in renal tissue on the third day in five groups of ratsA.normal group;B.model group;C.mizoribine group;D. mizoribine plus losartan group;E.losartan group;compared with normal group,*1P<0.05;compared with model group,*2P<0.05

圖3 5組大鼠第3天p27免疫熒光檢測(cè)結(jié)果A.正常組;B.模型組;C.咪唑立賓組;D.咪唑立賓+氯沙坦組;E.氯沙坦組;與正常組比較,*1P<0.05;與模型組比較,*2P<0.05Fig.3 p27mRNA expression on the third day in five groups of rats by immunofluorescence detectionA.normal group;B.model group;C.m izoribine group;D. mizoribine plus losartan group;E.losartan group;compared with normal group*1P<0.05;compared with model group,*2P<0.05

本研究發(fā)現(xiàn)正常組大鼠系膜細(xì)胞幾乎沒(méi)有增殖,模型組大鼠系膜細(xì)胞大量增殖,而給予咪唑立賓和氯沙坦治療后,系膜細(xì)胞輕度增殖或不增殖。且咪唑立賓及聯(lián)合用藥的作用優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用氯沙坦。咪唑立賓單獨(dú)用藥與聯(lián)合用藥之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示咪唑立賓能夠抑制系膜細(xì)胞增殖,并且作用優(yōu)于氯沙坦。該實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)證實(shí)了咪唑立賓具有抑制系膜細(xì)胞增殖的作用,這一結(jié)論與體外研究結(jié)論一致［5］。咪唑立賓單獨(dú)用藥與聯(lián)合用藥之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其原因可能是咪唑立賓通過(guò)多種途徑抑制系膜細(xì)胞增殖,而氯沙坦可能僅僅從影響血流動(dòng)力學(xué)途徑起作用［8］,具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

p27為細(xì)胞周期調(diào)控蛋白中最重要負(fù)性調(diào)控蛋白,可抑制大多數(shù)細(xì)胞周期蛋白-周期依賴性蛋白激酶(cyclin-CDK)復(fù)合物的激酶活性,對(duì)G1期的早期與晚期、S期等各期都有重要作用。許多研究表明p27可抑制系膜細(xì)胞增殖［9-10］。大鼠Thy1腎炎中p27與系膜細(xì)胞的增生程度呈負(fù)相關(guān),早期p27明顯下降,至系膜細(xì)胞增生最甚的第5天幾乎不能測(cè)及,隨后在系膜細(xì)胞停止增殖的恢復(fù)期p27水平回復(fù)到基礎(chǔ)值,表明p27的下降可使細(xì)胞周期從G1期進(jìn)展到S期,從而產(chǎn)生細(xì)胞增殖。CHIARA等［9］研究發(fā)現(xiàn)霉酚酸酯通過(guò)上調(diào)p27蛋白的表達(dá)抑制Thy1腎炎大鼠模型系膜細(xì)胞增殖。因此,將p27作為研究靶點(diǎn)很可能對(duì)系膜增殖性腎炎的治療有重要的意義。

本研究發(fā)現(xiàn)正常組大鼠p27蛋白表達(dá)處于平臺(tái)期,模型組p27的蛋白表達(dá)水平明顯減少。而給予咪唑立賓及氯沙坦治療后,治療組大鼠p27mRNA水平無(wú)明顯變化,p27的蛋白表達(dá)水平顯著增加,提示咪唑立賓能夠上調(diào)p27蛋白的表達(dá),且咪唑立賓及聯(lián)合用藥的作用顯著優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用氯沙坦的作用,但聯(lián)合用藥的作用與單獨(dú)應(yīng)用咪唑立賓的作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果還提示氯沙坦也能夠上調(diào)p27蛋白的表達(dá)抑制系膜細(xì)胞增殖。至于咪唑立賓的作用比氯沙坦的作用更強(qiáng),其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究表明咪唑立賓能夠通過(guò)上調(diào)p27蛋白表達(dá)抑制系膜細(xì)胞增殖,為咪唑立賓應(yīng)用于臨床治療系膜增殖性腎小球腎炎提供重要的理論依據(jù),為臨床治療系膜增殖性腎小球腎炎提供新的治療靶點(diǎn)。

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DOI 10.3870/yydb.2014.01.004

Effect of Mizoribine on p27 of Mesangial Cells in Rats with Acute Thy1 Nephritis

QIN Fu-fang1,SUN Qian1,SHAO Feng-min2
(1.Special Wards,People′s Hospital of Zhengzhou,Zhengzhou 450003,China;2.Department of Nephrology,Henan Provincial People′s Hospital,Zhengzhou 450003,China)

Objective To study the effect of mizoribine(MZ)on p27 of mesangial cells in rats with acute Thy1 nephritis.MethodsNinety male rats were random ly divided into five groups,which were normal,nephritic,mizoribine treated,losartan treated,bothmizoribine and losartan treated groups.Each group had 20 ratsexcept for normal group,which had ten rats.The nephritismodel was induced and renal tissue was removed 1,3,5,7 days aftermodel was established.Mesangial cells proliferation was determined by PAS staining.The expression of p27mRNA was detected by RT-PCR,and the protein expression was tested by western blotting.ResultsCompared with the control,themesangial cells proliferation in the nephritis model group was remarkably increased,but the expression of p27 protein was decreased significantly(P<0.05).Compared with the nephritis models,treatment with MZ,losartan or MZ p lus losartan showed an obvious inhibition of the mesangial cells proliferation(P<0.05),but significantly up-regulated expression of p27 protein(P<0.05),especially with the treatment of mizoribine,and losartan plus mizoribine.(P<0.05).ConclusionBoth mizoribine and losartan can inhibit mesangial proliferation in Thy1 nephritis,and the effect ofmizoribine ismore remarkable by up-regulation of the expression of p27 protein.

Mizoribine;Thy1 nephritis;Mesangial cell;p27

R979.5;R965

A

1004-0781(2014)01-0013-04

2012-11-23

2013-05-07

*河南省科技攻關(guān)基金資助項(xiàng)目(112102310127)

秦福芳(1974-),女,河南新鄉(xiāng)人,主治醫(yī)師,碩士,研究方向:慢性腎小球腎炎的發(fā)病機(jī)制。電話：0371-67077327,E-mail：qinfufang1781@126.com。