張素敏，王彤，劉海東，王禎，孫莉

（1.保定市第三中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北保定 071000；（2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北保定 071000）

葡萄糖和胰島素對(duì)SW480腫瘤細(xì)胞分泌IGF-1的影響

張素敏1，王彤2，劉海東1，王禎1，孫莉1

（1.保定市第三中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北保定 071000；（2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北保定 071000）

目的本實(shí)驗(yàn)?zāi)M2型糖尿病病程中葡萄糖、胰島素的濃度改變，研究不同濃度的葡萄糖、胰島素對(duì)SW480腫瘤細(xì)胞分泌IGF-1的影響。方法體外培養(yǎng)SW480腫瘤細(xì)胞。依據(jù)培養(yǎng)液中加入葡萄糖、胰島素濃度的不同，將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為六組：0組(對(duì)照組)：RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液；第1組：RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液+5 mmol/L葡萄糖和5 μIU/ml胰島素；第2組：RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液+5 mmol/L葡萄糖和125 μIU/ml胰島素；第3組：RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液+25 mmol/L葡萄糖和125 μIU/ml胰島素；第4組：RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液+25 mmol/L葡萄糖和5 μIU/ml胰島素；第5組：RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液+25 mmol/L葡萄糖和1.25 μIU/ml胰島素。每個(gè)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用ELISA方法檢測(cè)IGF-1的濃度。結(jié)果在高濃度的胰島素組(第2組、第3組，培養(yǎng)液中均含有125 μIU/ml的胰島素)IGF-1的濃度[(286.85±23.51)μg/L、(293.43±30.57)μg/L]高于對(duì)照組0組[(197.99±22.50)μg/L]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.726，P＜0.01)；而第1、4、5組(培養(yǎng)液中分別含有5 μIU/ml、5 μIU/ml、1.25 μIU/ml的胰島素)IGF-l的濃度[(203.22±28.89)μg/L、(209.47±25.77)μg/L、(195.33±20.88 μg/L)]與對(duì)照組0組相比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論高濃度的胰島素能夠上調(diào)SW480腫瘤細(xì)胞IGF-1的表達(dá)。

葡萄糖；胰島素；IGF-1；2型糖尿??；結(jié)直腸癌

近些年來(lái)2型糖尿病和結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐漸升高趨勢(shì)，可能與現(xiàn)代生活方式的改變、人口老齡化等因素有關(guān)。多項(xiàng)研究指出，2型糖尿病患者與未患糖尿病的人群相比較，結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯地升高，兩者存在著密切的關(guān)系[1-3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬2型糖尿病病程中，患者體內(nèi)葡萄糖、胰島素濃度的變化，研究2型糖尿病患者易患結(jié)直腸癌可能存在的因素。

1 材料與方法

1.1 材料人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480腫瘤細(xì)胞(購(gòu)于ATCC)；人IGF-1酶聯(lián)免疫試劑盒(購(gòu)于美國(guó)R＆D Systems公司)。

1.2 培養(yǎng)SW480腫瘤細(xì)胞復(fù)蘇SW480腫瘤細(xì)胞后，培養(yǎng)在10%新生牛清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入1%的青、鏈霉素，37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24～48 h更換培養(yǎng)液，細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)到90%后傳代。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組SW480腫瘤細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)，依據(jù)培養(yǎng)液中加入葡萄糖、胰島素的濃度不同，將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為六組：0組(對(duì)照組) RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液；第1組：RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液+5 mmol/L的葡萄糖和5 μIU/ml的胰島素；第2組：RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液+5 mmol/L的葡萄糖和125 μIU/ml的胰島素；第3組：RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液+25 mmol/L的葡萄糖和125 μIU/ml的胰島素；第4組：RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液+25 mmol/L的葡萄糖和5 μIU/ml的胰島素；第5組：RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液+25 mmol/L的葡萄糖和1.25 μIU/ml的胰島素。

1.4 收集SW480腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清SW480腫瘤細(xì)胞以2×105/ml接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)孔培養(yǎng)總量為3 ml，培養(yǎng)于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中48 h。結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，離心除去細(xì)胞碎片后，-70℃保存待檢。

1.5 檢測(cè)SW480腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IGF-l濃度使用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作?？谷薎GF-1的單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的IGF-1與單抗結(jié)合，洗滌后，加入底物A、B，在過(guò)氧化物酶催化下底物TMB轉(zhuǎn)化成為藍(lán)色，在酸的作用下轉(zhuǎn)化為最后的黃色。在450 nm處測(cè)OD值，IGF-1的濃度與OD值成正比，計(jì)算標(biāo)本中IGF-l的濃度。

2 結(jié)果

含高濃度的胰島素組（第2組、第3組）IGF-1的表達(dá)[(286.85±23.51)μg/L、(293.43±30.57)μg/L)]高于對(duì)照組0組[(197.99±22.50)μg/L]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.726，P＜0.01)；而第1、4、5組IGF-l的表達(dá)[(203.22±28.89)μg/L、(209.47±25.77)μg/L、（195.33± 20.88)μg/L)]與對(duì)照組0組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度的葡萄糖、胰島素對(duì)SW480腫瘤細(xì)胞分泌IGF-1的影響（±s）

表1 不同濃度的葡萄糖、胰島素對(duì)SW480腫瘤細(xì)胞分泌IGF-1的影響（±s）

注：a與對(duì)照組0組比較，aP＜0.01。

組別樣本數(shù)0 1 2 3 4 5 3 3 3 3 3 3 IGF-1的濃度(μg/L) 197.99±22.50 203.22±28.89 286.85±23.51a293.43±30.57a209.47±25.77 195.33±20.88 F值9.726 P值＜0.01

3 討論

胰島素樣生長(zhǎng)因子l(Insulin-1ike growth factor-l，IGF-1)在細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡及腫瘤的發(fā)生中均發(fā)揮著重要的作用。多項(xiàng)研究表明，2型糖尿病是結(jié)直腸癌的危險(xiǎn)因素之一，合并2型糖尿病的結(jié)直腸癌患者的復(fù)發(fā)率和死亡率增加[4-5]。Chi等[6]的薈萃分析表明，在結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)中，IGF-1起了促進(jìn)的作用。研究表明[7]，結(jié)直腸癌患者血清中IGF-1升高，在復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的患者中均高于未發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的患者。

在2型糖尿病發(fā)病的過(guò)程中[8]，首先存在2型糖尿病的易感因素（遺傳因素和環(huán)境因素），血漿中葡萄糖、胰島素的濃度均正常；其次，出現(xiàn)胰島素抵抗和高胰島素血癥，胰島β細(xì)胞代償性增加胰島素的分泌量，血漿葡萄糖的濃度尚能正常；再次，β細(xì)胞功能出現(xiàn)缺陷，胰島素分泌代償性的增多仍不能夠滿(mǎn)足機(jī)體的需要，血糖的濃度逐漸升高，出現(xiàn)高葡萄糖、高胰島素血癥；最后，β細(xì)胞功能出現(xiàn)失代償，胰島素的分泌量漸進(jìn)性減少，血糖明顯升高，出現(xiàn)高葡萄糖、低胰島素血癥。實(shí)驗(yàn)結(jié)果和2型糖尿病的病程相結(jié)合，在高胰島素血癥階段，高濃度的胰島素組(培養(yǎng)液中含125 μlU/ml的胰島素)增加了SW480腫瘤細(xì)胞IGF-1的分泌水平。

目前已有研究表明[9-10]，結(jié)直腸癌組織中IGF-1表達(dá)的陽(yáng)性率比癌旁組織明顯增高。Shiratsuchi等[11]的研究表明IGF-1的表達(dá)與結(jié)直腸癌腫瘤的大小及浸潤(rùn)的深度顯著相關(guān)。Wu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者血液中IGF-1升高，在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。結(jié)直腸癌組織中IGF-1受體的表達(dá)比正常的結(jié)腸黏膜增多，腫瘤的分級(jí)、分期和轉(zhuǎn)移與這種過(guò)多的表達(dá)關(guān)系密切，進(jìn)一步說(shuō)明了在結(jié)直腸癌發(fā)病中IGF-1的作用。目前，有關(guān)2型糖尿病引起結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高的可能機(jī)制，主要是胰島素抵抗和IGF-1的作用[13-14]。存在胰島素抵抗階段，患者體內(nèi)不僅胰島素的水平升高，并且IGF-l的水平也出現(xiàn)升高。胰島素通過(guò)增加肝臟中生長(zhǎng)激素受體的表達(dá)，促進(jìn)IGF-l的產(chǎn)生；胰島素還能直接抑制在肝臟中合成的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白，從而提高血液中IGF-1的水平[15]。

通過(guò)在體外研究不同濃度的葡萄糖、胰島素對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480腫瘤細(xì)胞IGF-1表達(dá)的影響，本實(shí)驗(yàn)為2型糖尿病患者易發(fā)生結(jié)直腸癌的可能機(jī)制提供了思路，IGF-1可否作為2型糖尿病患者發(fā)生結(jié)直腸癌的一項(xiàng)監(jiān)測(cè)指標(biāo)，來(lái)預(yù)示腫瘤發(fā)生的可能性，尚需要更深入的研究和探討。

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Effect of glucose and insulin on the secretion of IGF-1 in SW480 cancer cells.

ZHANG Su-min1,WANG Tong2, LIU Hai-dong1,WANG Zhen1,SUN Li1.1.Department of Endocrinology,The Third Central Hospital of Baoding City, Baoding 071000,Hebei,CHINA;2.The Affiliated Hospital of Hebei University,Baoding 071000,Heibei,CHINA

ObjectiveTo study the effect of different concentrations of glucose and insulin on the expression of IGF-1 in SW480 cancer cells by imitating the change of glucose and insulin in the course of type 2 diabetes mellitus.MethodsSW480 cancer cells were cultured in vitro.Based on the concentrations of glucose and insulin in cell culture medium,cells were divided into six groups:group 0(control):RPMI 1640;group 1:RPMI1 640+5 mmol/L glucose and 5 μIU/ml insulin;group 2:RPMI 1640+5 mmol/L glucose and 125 μIU/ml insulin;group 3:RPMI1640+25 mmol/L glucose and 125 μIU/ml insulin;group 4:RPMI1640+25 mmol/L glucose and 5 μIU/ml insulin;group 5: RPMI 1640+25 mmol/L glucose and 1.25 μIU/ml insulin.After put in different cell culture medium,cells were cultured for 48 hours,and the supernatant were gathered.The concentrations of IGF-1 were tested by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).ResultsIn the high concentration of insulin groups(group 2 and group 3,125 μIU/ml insulin in both culture medium),the expressions of IGF-1 were higher significantly than that of group 0[(286.85± 23.51)μg/L,(293.43±30.57)μg/L vs(197.99±22.50)μg/L,F=9.726,P＜0.01).In group 1,4,5,(5 μIU/ml,5 μIU/ml, 1.25 μIU/ml insulin in culture medium,respectively),there was no statistically significant difference compared to group 0[(203.22±28.89)μg/L,(209.47±225.77)μg/L,(195.33±20.88)μg/L vs(197.99±22.50)μg/L,P＞0.05). ConclusionHigh concentration of insulin may increase the expression of IGF-1 in SW480 cancer cells.

Glucose;Insulin;IGF-1;Type 2 Diabetes mellitus;Colorectal cancer

R730.22

A

1003—6350（2014）05—0633—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.05.0248

2013-09-16)

張素敏。E-mail：sky6@163.com