董小林，張少君，邱桂華，廖雪梅，楊潔

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院健康體檢中心，湖北十堰 442000）

BAALC蛋白在急性白血病中的表達(dá)及其臨床意義

董小林，張少君，邱桂華，廖雪梅，楊潔

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院健康體檢中心，湖北十堰 442000）

目的探討腦和急性白血病胞質(zhì)(Brain and acute leukemia cytoplasmic，BAALC)蛋白在急性髓細(xì)胞性白血病(Acute myeloid leukemia，AML)的表達(dá)及其臨床意義。方法采用Western blot方法半定量檢測(cè)BAALC蛋白在58例AML患者(初診24例、完全緩解28例和復(fù)發(fā)6例)的骨髓單個(gè)核細(xì)胞(Bone marrow mononuclear cells，BM-MNCs)的表達(dá)水平，15例非惡性血液病患者以及AML細(xì)胞系KG1α和HL-60分別作為陰性和陽性對(duì)照。結(jié)果KG1α和HL-60細(xì)胞BAALC均為陽性高表達(dá)，非惡性血液病對(duì)照者BAALC表達(dá)均為陰性。BAALC陽性率在AML初診組(83.3%)與復(fù)發(fā)組(100%)均高于完全緩解(CR)組(7.1%)和陰性對(duì)照組(0)(P＜0.001)；AML初診組和復(fù)發(fā)組的BAALC蛋白相對(duì)含量明顯高于CR組和陰性對(duì)照組(P＜0.01)，且CR組和陰性對(duì)照組之間BAALC表達(dá)陽性率和相對(duì)含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論BAALC蛋白在AML中表達(dá)水平異常增高，提示BAALC可能與AML的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

急性髓系白血病；BAALC；完全緩解

腦和急性白血病胞質(zhì)(Brain and acute leukemia cytoplasmic，BAALC)基因定位于人類染色體8q22.3，最初是在伴有8號(hào)染色體三體的AML中鑒定出來的[1]。正常情況下，BAALC基因主要表達(dá)在神經(jīng)組織(如：腦、脊索)和神經(jīng)外胚層來源組織(如腎上腺、甲狀腺、脾臟)及造血前體細(xì)胞如CD34+的早期造血細(xì)胞[2]，編碼的蛋白質(zhì)在高等哺乳動(dòng)物中的表達(dá)高度保守。近年來研究發(fā)現(xiàn)，BAALC mRNA在急性髓系白血病高表達(dá)，與AML患者的預(yù)后切相關(guān)，被認(rèn)為是AML預(yù)后較差的指標(biāo)之一[3-6]。目前，尚未發(fā)現(xiàn)BAALC基因編碼的蛋白與目前已知的蛋白有同源性，且BAALC蛋白在AML中的表達(dá)研究較少，功能尚不明確。我們采用Western blot方法半定量檢測(cè)了AML細(xì)胞系KG1α和HL-60以及58例AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞(Bone marrow mononuclear cells，BM-MNCs)中的BAALC蛋白表達(dá)，并收集了AML患者的臨床資料，追蹤觀察臨床療效，并了解不同病情(初診、完全緩解、復(fù)發(fā))AML患者BAALC的表達(dá)水平，初步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料病例來自2010年3月至2012年8月期間我院血液科住院或者門診隨訪AML患者58例，男性33例，女性25例，中位年齡45歲(21～69歲)。AML的診斷、完全緩解、復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)按張之南主編《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[7]，其中初診24例(M02例，M29例，M32例，M511例)，完全緩解(CR)28例(M28例，M38例，M510例)和復(fù)發(fā)6例(M01例，M23例，M52例)。初診的AML患者接受誘導(dǎo)緩解治療，包括DA(柔紅霉素+阿糖胞苷)、IA(去甲柔紅霉素+阿糖胞苷)、NV(米托蒽醌+衛(wèi)萌)等化療方案，M3首選全反式維甲酸+DA。獲得CR的患者隨后給予鞏固治療、維持治療或進(jìn)行造血干細(xì)胞移植。非惡性血液病患者15例作為陰性對(duì)照，其中巨幼細(xì)胞性貧血3例，缺鐵性貧血(IDA)6例，特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)6例。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑人淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll，北京西美杰科技有限公司)，PIPAⅠ型全蛋白抽提試劑盒(美國(guó)DBI Bioscience)，BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技有限公司)，兔抗人BAALC多克隆抗體(美國(guó)Abcam)，β-actin抗體和二抗(HRP標(biāo)記羊抗兔IgG)(美國(guó)Santa Cruz)，PVDF蛋白印記膜(美國(guó)MilliPore)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)Pierce)。

1.2.2 AML細(xì)胞系與細(xì)胞培養(yǎng)KG1α細(xì)胞和HL-60細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫。HL-60細(xì)胞和KG1α細(xì)胞分別接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，作為本研究的陽性對(duì)照組。

1.2.3 標(biāo)本采集及單個(gè)核細(xì)胞分離抽取骨髓液2～5 ml，用肝素抗凝，以磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋后加入人淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)上，離心20 min，分離得到單個(gè)核細(xì)胞，PBS洗滌兩次，細(xì)胞沉淀于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 Western blot檢測(cè)按照RIPA全蛋白抽提試劑盒的說明提取細(xì)胞總蛋白，用BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白定量。以每孔40 μg上樣，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%BSA室溫封閉1 h。BAALC抗體(1:1 200)4℃孵育過夜，以β-actin抗體(1:2 000)為內(nèi)參照，二抗IgG-HRP(1:4 000)室溫孵育1 h，TBST振蕩洗滌，加入ECL發(fā)光液顯色曝光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用Image-Pro Plus 6.0軟件分析BAALC與β-actin的灰度比值代表BAALC蛋白的相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析，組間均數(shù)的比較采用LSD檢驗(yàn)，率的比較采用Pearson Chi-Square(χ2)檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BAALC蛋白在非惡性血液病對(duì)照者和AML細(xì)胞系中的表達(dá)15例非惡性血液病對(duì)照者BAALC蛋白BAALC相對(duì)含量為(0.041±0.032)，均為陰性。在KG1α和HL-60白血病細(xì)胞株中BAALC均為高表達(dá)，BAALC相對(duì)半定量值(BAALC/β-actin灰度比)分別為(3.247±0.640)和(1.842±0.385)(n=3，圖1A)。根據(jù)陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組以及實(shí)驗(yàn)組中BAALC蛋白表達(dá)水平，該實(shí)驗(yàn)中選定BAALC/β-actin灰度比值≥0.1為高表達(dá)，＜0.1為低表達(dá)，以此計(jì)算BAALC表達(dá)的陽性率。

2.2 AML患者BAALC蛋白的表達(dá)AML患者BAALC蛋白表達(dá)陽性率在初診組(83.3%)和復(fù)發(fā)組(100%)均高于CR組(7.1%)和陰性對(duì)照組(0)(P＜0.001)，CR組和陰性對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值= 0.09，P=0.764)。采用Pearson Chi-Square(χ2)檢驗(yàn)比較不同組間BAALC蛋白的表達(dá)水平，CR組與陰性組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.122)，而初診組和復(fù)發(fā)組BAALC蛋白明顯低于CR組和陰性對(duì)照組(P＜0.05)。有3例AML患者在疾病的不同時(shí)期檢測(cè)出BAALC的高表達(dá)：1例M5患者BAALC/β-actin初診時(shí)為1.353，CR時(shí)為3.329，且隨訪該患者CR后4個(gè)月復(fù)發(fā)；1例M2a患者初診時(shí)為2.629，經(jīng)化療達(dá)完全緩解后，BAALC表達(dá)量將至0.173；另1例M2患者CR時(shí)為0.087，復(fù)發(fā)時(shí)為1.376(圖1B)。

圖1 BAALC在AML患者和細(xì)胞系中的表達(dá)情況

3 討論

白血病的發(fā)生和發(fā)展與多種相關(guān)致癌基因過表達(dá)或(和)抑癌基因失活有關(guān)，其中某些基因的異常表達(dá)起關(guān)鍵作用。BAALC基因是近年來研究發(fā)現(xiàn)的與AML的發(fā)生和預(yù)后有密切關(guān)聯(lián)的重要基因之一。BAALC基因最初發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)外胚層來源的組織中表達(dá)，隨后研究發(fā)現(xiàn)來自骨髓的CD34+祖細(xì)胞也表達(dá)BAALC mRNA，在骨髓祖細(xì)胞分化過程中，BAALC的表達(dá)水平不斷下調(diào)[8-9]，而且BAALC基因主要表達(dá)于這兩種組織和細(xì)胞。Tanner等[1]研究發(fā)現(xiàn)AML、ALL及CML急變期患者可檢測(cè)到BAALC基因的高表達(dá)，而CML慢性期患者及CLL患者則檢測(cè)不到。國(guó)內(nèi)研究者采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)到正常成人骨髓中也存在BAALC mRNA的低表達(dá)[10]。研究表明，BAALC mRNA在新診斷的正常核型AML高表達(dá)，與完全緩解失敗、原發(fā)性耐藥和明顯短的總生存和高的復(fù)發(fā)率有關(guān)[11-12]，被認(rèn)為是AML患者的預(yù)后不良指標(biāo)。也有研究報(bào)道在成人前體B細(xì)胞ALL患者中，BAALC基因過表達(dá)的患者也具有較差的總生存率[13-14]。前述研究主要集中于研究BAALC基因mRNA表達(dá)水平與AML的預(yù)后關(guān)系，而BAALC蛋白在AML發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用尚不清楚。

我們用Western blot方法檢測(cè)了BAALC蛋白在KG1α和HL-60白血病細(xì)胞系、AML患者以及非惡性血液病患者對(duì)照BM-MNCs中的表達(dá)。結(jié)果表明，BAALC蛋白在KG1α和HL-60細(xì)胞均呈高表達(dá)，在非惡性血液病對(duì)照組表達(dá)極低甚至不能測(cè)出，而在AML患者初診、完全緩解和復(fù)發(fā)不同病情時(shí)表達(dá)程度差異較大，初診和復(fù)發(fā)患者BAALC蛋白明顯高于完全緩解患者和非惡性血液病患者，且完全緩解和非惡性血液病患者之間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中發(fā)現(xiàn)，1例AML患者BAALC在初診時(shí)BAALC表達(dá)已有升高，復(fù)發(fā)時(shí)BAALC表達(dá)進(jìn)一步升高；另1例AML患者初診時(shí)BAALC表達(dá)升高，經(jīng)治療達(dá)CR后BAALC表達(dá)下降。

BAALC蛋白的功能研究報(bào)道較少。有研究者成功構(gòu)建BAALC基因的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染人HL60/ADM、MOLT-4和K562細(xì)胞株篩選得到穩(wěn)定過表達(dá)該基因細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)BAALC基因能促進(jìn)HL60/ADM細(xì)胞株的增殖、抑制凋亡及增加HL60/ADM細(xì)胞株拮抗As203誘導(dǎo)凋亡的能力[15]。BAALC基因沉默后能抑制KG1α細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。表明BAALC基因可能在AML的發(fā)生發(fā)展過程中起促進(jìn)作用。

綜上所述，BAALC在AML的發(fā)生、進(jìn)展及演變過程中可能發(fā)揮了重要作用，從而有可能成為AML治療的新靶點(diǎn)。

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Expression significance of BAALC in acute myeloid leukemia.

DONG Xiao-lin,ZHANG Shao-jun,QIU Gui-hua, LIAO Xue-mei,YANG Jie.Physical Examination Center,People's Hospital Affiliated to Hubei Medicine College,Shiyan 442000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression and its significance of brain and acute leukemia cytoplasmic(BAALC)in acute myeilod leukemia(AML).MethodsBAALC level was assessed by Western blot in the bone marrow mononuclear cells(BM-MNCs)of 58 AML patients,including 24 newly diagnosed patients,28 complete remission patients and 6 relapsing patients,15 nonmalignant hematopathy patients as negative controls and AML cell line KG1α and HL-60 as positive controls.ResultsThe expression of BAALC was positive in KG1α and HL-60 cells but negative in 15 negative controls.The BAALC positive rate in AML newly diagnosed group(83.3%) and relapsing group(100%)was higher than that in complete remission(CR)group(7.1%)and negative control group (P＜0.001).BAALC relative amount in AML newly diagnosed group and relapse group was significantly higher than that in CR group and negative control group(P＜0.01).The positive rate and relative amount of BAALC showed no statistically difference between CR group and negative controls.ConclusionBAALC is overexpressed in AML patients,suggesting that BAALC is associated with the development ofAML.

Acute myeloid leukemia;BAALC;Complete remission

R733.71

A

1003—6350(2014)05—0639—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.05.0250

2013-05-28)

楊潔。E-mail：146653354@qq.com