李歡 何炎森 李科 申艷紅 吳用 陳曉靜

摘 要 以‘黃花水仙2號(hào)和‘金盞銀臺(tái)為材料，根據(jù)課題組已克隆出的多花水仙轉(zhuǎn)錄因子WRKY基因片段設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)RACE技術(shù)分別從2個(gè)水仙品種中克隆出2個(gè)不同的WRKY基因，命名為NtWRKY40a和NtWRKY40b，開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度分別為945和951個(gè)堿基。序列分析結(jié)果表明，兩序列均含有WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域；‘黃花水仙2號(hào)與‘金盞銀臺(tái)、擬南芥、葡萄、青蒿、小麥和粳稻的相似系數(shù)分別為：97.27%、45%、43%、47%、41%和43%。Real-time PCR分析結(jié)果表明：WRKY基因在花瓣和副冠開(kāi)花過(guò)程中的表達(dá)量發(fā)生變化，說(shuō)明其可能參與多花水仙花朵的衰老過(guò)程。

關(guān)鍵詞 中國(guó)水仙；WRKY轉(zhuǎn)錄因子；基因克??；序列分析

中圖分類(lèi)號(hào) S682.21 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF），是位于細(xì)胞核內(nèi)能夠與基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的蛋白質(zhì)分子，其主要功能是激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)[1]。近年來(lái)，已相繼從高等植物中分離出一系列應(yīng)對(duì)干旱、高鹽、低溫、激素、病原反應(yīng)及發(fā)育等相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子[2]。隨著人們對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)和功能的深入了解，人為的控制植物特定基因的表達(dá)來(lái)改良作物品質(zhì)，已成為一種快捷、高效而頗具潛力的育種途徑。

WRKY作為植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，其蛋白質(zhì)N-端含有高度保守的WRKYGQK氨基酸序列，C-端含有1個(gè)鋅指型結(jié)構(gòu)（Cys2His2或Cys2His/Cys），通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域W-box（C/TTGACT/C）的特異結(jié)合而調(diào)控基因的表達(dá)[3]。研究結(jié)果表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和各種生理進(jìn)程，在一定程度上，可通過(guò)激活或抑制其他TF和調(diào)節(jié)WRKY基因的前饋和反饋循環(huán)，直接作用下游靶基因，其對(duì)水楊酸、機(jī)械損傷和病原防御等許多因子的應(yīng)答具有迅速、短暫的特點(diǎn)[4-5]。Ishiguro等[6]最早從甘薯中發(fā)現(xiàn)WRKY因子，之后在野燕麥[7]、歐芹[8]，擬南芥[9]等植物中也相繼克隆和分離出WRKY。但尚未見(jiàn)到有關(guān)水仙WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的報(bào)道。為此，本研究以多花水仙為材料，根據(jù)多花水仙花瓣抑制消減雜交cDNA文庫(kù)[10]獲得的WRKY轉(zhuǎn)錄因子EST序列設(shè)計(jì)特異引物，利用RACE和RT-PCR技術(shù)克隆水仙WRKY基因全長(zhǎng)，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為后續(xù)WRKY基因的功能研究及從轉(zhuǎn)錄水平上改善水仙的觀賞價(jià)值奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用的多花水仙主要有兩種類(lèi)型：雙色花水仙‘金盞銀臺(tái)取自漳州水仙花生產(chǎn)地；‘黃花水仙2號(hào)，由福建農(nóng)林大學(xué)園藝遺傳育種研究所提供?！鸨K銀臺(tái)副冠淺黃色，花瓣白色；‘黃花水仙2號(hào)花瓣和副冠均為黃色，花瓣顏色較副冠深。取花蕾期、始花期、盛花期和衰敗期花朵，用鑷子小心除去花絲、花藥和柱頭，液氮速凍于-80 ℃下貯藏備用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 使用離心柱型多糖多酚RNA提取試劑盒（購(gòu)自北京百泰克生物限公司）分別提取‘金盞銀臺(tái)和‘黃花水仙2號(hào)花蕾期、始花期、盛花期和衰敗期的花瓣與副冠的總RNA。用Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（購(gòu)自Fermenta）合成的cDNA用于3′-RACE。用Super SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（購(gòu)自Contech公司）合成的cDNA用于5′-RACE。用SYBRPrimeScriptRT-PCR Kit（Perfect Real Time）試劑盒（購(gòu)自TaKaRa）合成的cDNA用于qRT-PCR。具體的RT反應(yīng)參照Fermenta、Contech和TaKaRa公司的使用說(shuō)明書(shū)。

1.2.2 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)課題組已經(jīng)獲得的WRKY轉(zhuǎn)錄因子片段和多花水仙的EST序列設(shè)計(jì)特異引物（見(jiàn)表1）。引物合成和基因測(cè)序均委托北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2.3 ‘黃花水仙2號(hào)WRKY基因cDNA全長(zhǎng)克隆

以‘黃花水仙2號(hào)的cDNA為模板分別進(jìn)行5′-RACE和3′-RACE的擴(kuò)增。反應(yīng)體系均采用25 μL和35 cycle、退火時(shí)間均為90 s。3′端序列的克隆，第一輪PCR反應(yīng)上下游引物分別為：WRKY 3′-1和AUAP。第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋10倍作為模板，以WRKY 3′-2和AUAP為引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。5′端序列的克隆，以WRKY 5′-1和UPM為引物進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，將第一輪產(chǎn)物稀釋10倍為模板，以WRKY 5′-2和UPM為引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。

1.2.4 ‘黃花水仙2號(hào)和‘金盞銀臺(tái)ORF的獲得

測(cè)序結(jié)果用Sequencher4.2除去18-T和通用引物序列，拼接WRKY基因的5′端、3′端，并于NCBI上預(yù)測(cè)其保守區(qū)。根據(jù)ORF兩端序列設(shè)計(jì)特異引物，以WRKY-F和WRKY-R分別為上下游引物擴(kuò)增2種水仙的編碼區(qū)。凝膠電泳后回收目的片段，連接至PGEM載體并轉(zhuǎn)化DH5α（Escherichia coli.），菌液鑒定后測(cè)序。

1.2.5 序列拼接及生物信息學(xué)分析 引物設(shè)計(jì)、序列拼接及分析使用DNAMAN、Primer5.0和Sequencher4.2。氨基酸多重序列比對(duì)和CDD功能區(qū)域分析使用NCBI中的BLASTX（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）；氨基酸理化分析使用ExPASy-ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam）；構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)使用MEGA5.05中的鄰近相法neighbor-joining tree；氨基酸序列信號(hào)肽預(yù)測(cè)使用SignalP 4.1Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）；氨基酸序列跨膜預(yù)測(cè)使用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）；亞細(xì)胞定位使用softberry（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml）。

1.2.6 ‘黃花水仙2號(hào)和‘金盞銀臺(tái)qRT-PCR的檢測(cè)與分析 將2種水仙的cDNA模板稀釋5倍，以actin（genebank acession： JN204912.1）為內(nèi)參基因，WRKY-U和WRKY-D為上下游引物來(lái)檢測(cè)WRKY基因在2種水仙不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄水平。使用25 μL qRT-PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqTM（2×）12.5 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.5 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.5 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 9.5 μL，每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)。qRT-PCR程序?yàn)椋篠tage1： 預(yù)變性，94 ℃，3 min；Stage2： PCR反應(yīng)，94 ℃變性15s；56 ℃退火35 s，循環(huán)40 cycle。Stage3： Dissociation。反應(yīng)結(jié)束后，分析Bio-Rad CFX96中的熔解曲線和擴(kuò)增曲線，導(dǎo)出數(shù)據(jù)。從不同時(shí)期的相關(guān)基因擴(kuò)增曲線中得到Ct值，通過(guò)actin的校正最終得到目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用2-△△ct（Livak）法，并用Excel和geNorm程序處理和分析熒光數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多花水仙WRKY基因cDNA全長(zhǎng)克隆

以‘黃花水仙2號(hào)RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，用特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，5′RACE和3′RACE分別得到1條與預(yù)測(cè)相當(dāng)約為600 bp的片段（見(jiàn)圖1）。測(cè)序后將其同原始EST序列拼接，得到長(zhǎng)度為1 122 bp的序列，開(kāi)放閱讀框945 bp，5′端非編碼區(qū)85 bp，3′端非編碼區(qū)92 bp，初步判斷已經(jīng)獲得WRKY基因的cDNA全長(zhǎng)。

2.2 ‘黃花水仙2號(hào)和‘金盞銀臺(tái)WRKY基因ORF的獲得與分析

根據(jù)拼接的‘黃花水仙2號(hào)的cDNA全長(zhǎng)，設(shè)計(jì)上下游引物，克隆‘黃花水仙2號(hào)和‘金盞銀臺(tái)WRKY基因的開(kāi)放閱讀框。結(jié)果擴(kuò)增出大約1 000 bp的條帶（見(jiàn)圖1）。測(cè)序結(jié)果表明，‘黃花水仙2號(hào)ORF為945 bp，編碼314個(gè)氨基酸；‘金盞銀臺(tái)ORF為951 bp，編碼316個(gè)氨基酸?！S花水仙2號(hào)和‘金盞銀臺(tái)的WRKY基因分別命名為NtWRKY40a和NtWRKY40b。

2.3 多花水仙WRKY的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy-ProtParam等在線工具推測(cè)2種水仙WRKY蛋白的基本理化性質(zhì)（見(jiàn)表2），2種水仙WRKY都屬于酸性和疏水性蛋白，且等電點(diǎn)均為5.09。由于氨基酸的個(gè)別差異，可能導(dǎo)致了它們?cè)诘鞍踪|(zhì)分子量、分子式、GRAVY值和不穩(wěn)定指數(shù)上的不同。綜合推測(cè)2種類(lèi)型的水仙WRKY蛋白均不存在信號(hào)肽，為非分泌蛋白。其跨膜螺旋數(shù)均為0，未形成跨膜區(qū)域，不是膜蛋白，且亞細(xì)胞均定位于葉綠體上的可能性比較大。

保守區(qū)域分析結(jié)果表明，該蛋白屬于WRKY超基因家族的成員。對(duì)其開(kāi)放閱讀框所推導(dǎo)的氨基酸進(jìn)行同源序列分析（見(jiàn)圖2），黃花水仙2號(hào)同擬南芥（Arabidopsis thaliana，NP_178199.1）、葡萄（Vitis pseudoreticulata，AEN71143.1）、青蒿（Artemisia annua，ADI56655.1）、小麥（Triticum aestivum，AFW98256.1）、粳稻（Oryza sativa Japonica，NP_

001046094.1）的同源性分別為：45%、43%、47%、41%、43%，說(shuō)明這個(gè)基因的保守性差；‘黃花水仙2號(hào)與‘金盞銀臺(tái)亦存在一定的差異，同源性為：97.27%。為了研究WRKY的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建了WRKY的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（見(jiàn)圖3），結(jié)果表明，‘黃花水仙2號(hào)和‘金盞銀臺(tái)處于同一分支，與‘黃花水仙2號(hào)進(jìn)化比較相近的為粳稻，其次是大麥和小米，再就是玉米，二穗短柄草，它們都屬于單子葉植物，與雙子葉植物華東葡萄、蘋(píng)果、青蒿等進(jìn)化距離相對(duì)較遠(yuǎn)。總體上，此進(jìn)化樹(shù)與植物分類(lèi)學(xué)基本一致。

2.4 多花水仙WRKY在不同發(fā)育期的表達(dá)分析

在多花水仙開(kāi)花的過(guò)程中，同一品種不同時(shí)期WRKY基因表達(dá)量的結(jié)果顯示（見(jiàn)圖4）：NtWRKY40a的轉(zhuǎn)錄水平在花瓣（P）和副冠（C）上有類(lèi)似的變化趨勢(shì)，即在前花蕾期、始花期和盛花期呈上升趨勢(shì)，在衰敗期表現(xiàn)為下調(diào)；花瓣和副冠中相臨花期NtWRKY40a基因表達(dá)量相差分別約為5倍和4倍，但C較P轉(zhuǎn)錄水平低。P和C中NtWRKY40b的表達(dá)量在花蕾、始花、盛花期差異不顯著，差別較小，但在衰敗期表現(xiàn)為明顯差異，較前3花期比值分別為10和5倍左右，與NtWRKY40a相似，NtWRKY40b在C中的轉(zhuǎn)錄水平較P低。

3 討論與結(jié)論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的超基因家族之一，也是調(diào)控植物信號(hào)網(wǎng)絡(luò)必不可少的部分。WRKY基因在植物中的表達(dá)是非組成性的，具有瞬時(shí)、迅速、組織特異性的特點(diǎn)。一般將WRKY蛋白分為3大類(lèi)型：Ⅰ類(lèi)含有2個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H；Ⅱ類(lèi)含有1個(gè)保守域，鋅指結(jié)構(gòu)與第Ⅰ類(lèi)相同，目前已發(fā)現(xiàn)的WRKY大多數(shù)是此類(lèi)型；Ⅲ類(lèi)也有1個(gè)保守域，但鋅指結(jié)構(gòu)為C-X7-C-X22-23-H-X-C[4]。本研究中NtWRKY40a和NtWRKY40b均有1個(gè)WRKY保守域和1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，因此屬于第Ⅲ類(lèi)WRKY蛋白。已研究的第Ⅲ類(lèi)WRKY轉(zhuǎn)錄因子幾乎全和植物的生物脅迫應(yīng)答有關(guān)，2種水仙WRKY在開(kāi)花過(guò)程中均呈現(xiàn)出一定的階段性和時(shí)序性，可能是多花水仙參與自然共同進(jìn)化及對(duì)不同環(huán)境適應(yīng)性衍化的結(jié)果。

伴隨植物的進(jìn)化，衰老是不可避免的過(guò)程，通常被認(rèn)為是細(xì)胞程序性死亡的一種類(lèi)型并由細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)所控制[11]。目前，植物衰老的原因還不清楚，植物衰老研究對(duì)提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)品器官質(zhì)量、作物增產(chǎn)及優(yōu)良性狀保持等有重大意義。已有的基因組和轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，許多轉(zhuǎn)錄因子家庭基因參與了植物的衰老調(diào)控，如WRKY、bZIP、NAC和MYB等。Robatzek等[12]研究已經(jīng)證明AtWRKY6與擬南芥葉片的衰老有關(guān)，不同器官的轉(zhuǎn)錄水平顯示，AtWRKY6在根、花朵、衰老的葉片中有很高的表達(dá)量。也有研究者發(fā)現(xiàn)AtWRKY70的功能缺失突變體及OsWRKY23的過(guò)表達(dá)分別會(huì)加速擬南芥和水稻提前衰老[13-14]。本研究中，多花水仙WRKY基因的轉(zhuǎn)錄水平表明，花瓣和副冠中的NtWRKY40a在盛花期和衰敗期表達(dá)量均最高，較花蕾期和始花期有明顯差異，這可能與NtWRKY40a參與了‘黃花水仙2號(hào)花瓣的衰老過(guò)程有關(guān)；NtWRKY40b在花瓣和副冠的前3個(gè)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著差異，而在衰敗期表現(xiàn)出較大差異，這可能是衰老誘導(dǎo)了‘金盞銀臺(tái)花朵中WRKY基因表達(dá)量的增加。第4個(gè)時(shí)期的NtWRKY40b及整個(gè)花期的NtWRKY40a在花瓣和副冠中的轉(zhuǎn)錄水平差異很大，但具體相關(guān)機(jī)理尚不清楚，有待于課題組進(jìn)一步研究。

隨著研究的不斷深入，WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能也日益揭示出來(lái)。近年來(lái)，WRKY基因的研究主要集中在擬南芥等模式植物和水稻等經(jīng)濟(jì)作用的基因克隆和功能分析中，而尚未涉及有關(guān)多花水仙WRKY基因的報(bào)道。本研究中，首次從多花水仙中分離出WRKY基因，并對(duì)其生物信息學(xué)進(jìn)行初步分析，將有助于研究該基因功能，為下一步利用基因工程在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控中國(guó)水仙的生長(zhǎng)發(fā)育奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] Jain M， Tyagi A K， Khurana J P. Genome-wide identification， classification， evolutionary expansion and expression analyses of homeobox genes in rice[J]. FEBS Journal， 2008， 275（11）： 2 845-2 861.

[2] 劉 強(qiáng)， 張貴友. 植物轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與調(diào)控作用[J]. 科學(xué)通報(bào)， 2000， 45（14）： 1 465-1 474.

[3] Eulgem T， Somssich I E. Networks of WRKY transcription factors in defense signaling[J]. Current opinion in plant biology， 2007， 10（4）： 366-371.

[4] Eulgem T， Rushton P J， Robatzek S， et al. The WRKY superfamily of plant transcription factors[J]. Trends in Plant Science， 2000， 5（5）： 199-206.

[5] Pandey S P， Somssich I E. The role of WRKY transcription factors in plant immunity[J]. Plant Physiology， 2009， 150（4）： 1 648-1 655.

[6] Ishiguro S， Nakamura K. Characterization of a cDNA encoding a novel DNA-binding protein， SPF1， that recognizes SP8 sequences in the 5′upstream regions of genes coding for sporamin and β-amylase from sweet potato[J]. Molecular and General Genetics MGG， 1994， 244（6）： 563-571.

[7] Rushton P J， Macdonald H， Huttly A K， et al. Members of a new family of DNA-binding proteins bind to a conserved cis-element in the promoters of α-Amy2 genes[J]. Plant Molecular Biology， 1995， 29（4）： 691-702.

[8] Rushton P J， Torres J T， Parniske M， et al. Interaction of elicitor-induced DNA-binding proteins with elicitor response elements in the promoters of parsley PR1 genes[J]. The EMBO Journal， 1996， 15（20）： 5 690.

[9] de Pater S， Greco V， Pham K， et al. Characterization of a zinc-dependent transcriptional activator from Arabidopsis[J]. Nucleic Acids Research， 1996， 24（23）： 4 624-4 631.

[10] 何炎森， 何瑋毅， 陳曉靜. 多花水仙花瓣抑制消減雜交 cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建及分析[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)： 自然科學(xué)版， 2013， 42（3）： 289-296.

[11] Agarwal P， Reddy M P， Chikara J. WRKY： its structure， evolutionary relationship， DNA-binding selectivity， role in stress tolerance and development of plants[J]. Molecular Biology Reports， 2011， 38（6）： 3 883-3 896.

[12] Robatzek S， Somssich I E. A new member of the Arabidopsis WRKY transcription factor family， AtWRKY6， is associated with both senescence-and defence‐related processes[J]. The Plant Journal， 2001， 28（2）： 123-133.

[13] Ulker B， Mukhtar M S， Somssich I E. The WRKY70 transcription factor of Arabidopsis influences both the plant senescence and defense signaling pathways[J]. Planta， 2007， 226（1）： 125-137.

[14] Jing S， Zhou X， Song Y， et al. Heterologous expression of OsWRKY23 gene enhances pathogen defense and dark-induced leaf senescence in Arabidopsis[J]. Plant Growth Regulation， 2009， 58（2）： 181-190.

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