郭冬 李輝亮 楊子平 彭世清

摘 要 為研究橡膠樹(shù)中法尼基焦磷酸合酶基因（HbFPS）的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，采用酵母單雜交技術(shù)篩選了膠乳中與HbFPS啟動(dòng)子結(jié)合的蛋白因子。將HbFPS啟動(dòng)子與報(bào)告質(zhì)粒pHIS2.1連接構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pHis-FPS，經(jīng)篩選確定抑制背景表達(dá)的3-氨基三唑（3-aminotriazole，3-AT）濃度為10 mmol/L。同時(shí)以橡膠樹(shù)膠乳mRNA為模板合成雙鏈cDNA，并將雙鏈cDNA、線性化的pGADT7Rec2載體和誘餌質(zhì)粒pHis-FPS共同轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187，兩載體共轉(zhuǎn)化效率為1.7×106 cfu/μg。篩選共得到陽(yáng)性克隆36個(gè)，獲得31條序列。對(duì)獲得的cDNA序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，得到2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列，分別為類乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子ERF003和HbLMYC2。結(jié)果為進(jìn)一步研究HbFPS表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 橡膠樹(shù)；法尼基焦磷酸合酶；轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

法尼基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PS）是植物類異戊二烯合成途徑中的一個(gè)重要關(guān)鍵酶，催化2分子的異戊烯基焦磷酸和1分子的二甲基丙烯基焦磷酸以1，4頭尾連續(xù)縮合反應(yīng)，形成15碳的法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）[1]。FPP是植物體內(nèi)甾醇、三萜、長(zhǎng)醇、泛醌、類胡蘿卜素、橡膠等許多萜類衍生物質(zhì)的合成前體[2]。目前在植物中關(guān)于FPS的研究主要集中在基因克隆、表達(dá)特性分析和過(guò)量表達(dá)對(duì)次生代謝產(chǎn)物的影響[3-6]。研究結(jié)果表明，F(xiàn)PS的過(guò)量表達(dá)會(huì)提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[7-8]，在青蒿（Artemisia annua）中過(guò)量表達(dá)AaFPS，轉(zhuǎn)基因植株中青篙素的含量比對(duì)照組高30%左右[9]；Chen等[10]將棉花的FPS在青篙中過(guò)量表達(dá)，轉(zhuǎn)基因發(fā)根系中青篙素含量約為對(duì)照組的3～4倍，轉(zhuǎn)基因植株中青篙素的含量比對(duì)照組高2～3倍；在積雪草（Centella asiatica）過(guò)量表達(dá)來(lái)自人參的FPS，轉(zhuǎn)基因植株中植物甾醇和三萜烯含量有明顯的提高[4]。而對(duì)FPS轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控因子的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

天然橡膠的生物合成是一種典型的植物類異戊二烯的次生代謝途徑。同位示蹤術(shù)和核磁共振成像技術(shù)的研究結(jié)果表明，F(xiàn)PP是橡膠生物合成的起始物[11]。橡膠生物合成的速率與細(xì)胞內(nèi)的FPP濃度呈正相關(guān)，F(xiàn)PP濃度越高，橡膠合成的速率越大[12]。由于HbFPS是天然橡膠生物合成途徑中的一個(gè)重要關(guān)鍵酶，因此，研究HbFPS的表達(dá)調(diào)控機(jī)制對(duì)促進(jìn)天然橡膠生物合成有重要意義。尋找與HbFPS調(diào)控序列中順式作用元件特異結(jié)合蛋白，是進(jìn)一步研究HbFPS表達(dá)調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵。酵母單雜交系統(tǒng)是目前廣泛應(yīng)用于克隆和鑒定動(dòng)植物轉(zhuǎn)錄因子的有效方法。本研究在分離HbFPS 5′調(diào)控序列的基礎(chǔ)上[13]，通過(guò)酵母單雜交技術(shù)篩選得到與其結(jié)合的蛋白，以期為獲得調(diào)控HbFPS表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子并研究其調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 巴西橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis）7-33-97種植于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)。采集幼葉進(jìn)行橡膠樹(shù)基因組DNA提取。膠乳采樣按Tang等[14]的方法進(jìn)行，再用液氮收集。

1.1.2 質(zhì)粒、試劑和菌種 克隆載體pMD19T simple Vector、限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司。mRNA 分離和純化試劑盒polyATtract mRNA Isolation Systems III Kit、IPTG、X-gal和dNTPs購(gòu)于promega公司。酵母單雜交系統(tǒng)MatchmakerTM One-hybrid Library Construction & Screening Kit購(gòu)自Clontech 公司。E.coli DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。DNA合成和測(cè)序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 HbFPS啟動(dòng)子誘餌載體的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)pHIS2.1多克隆位點(diǎn)信息，對(duì)前期報(bào)道的HbFPS啟動(dòng)子序列[13]進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，設(shè)計(jì)一對(duì)特異上游和下游引物，并分別引入MluⅠ和SpeⅠ酶切位點(diǎn)，引物序列為pFPSF：5′-CCGACGCGTCTGCAT

TTTTATGATTAA-3′和pFPSR：5′-GCGACTAGTGG

ATTCAAACGGAGATTAG-3′。以橡膠樹(shù)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：在0.2 mL的離心管中加入1 μL DNA、10×PCR反應(yīng)緩沖液（含MgCl2）2 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、10 μmol/L引物各0.3 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。將純化的PCR產(chǎn)物克隆至pMD19T simple Vector，轉(zhuǎn)至DH5α，抽提質(zhì)粒，測(cè)序鑒定，獲得重組質(zhì)粒pMD19-FPS。將pMD19-FPS用MluⅠ和SpeⅠ進(jìn)行雙酶切并回收目標(biāo)片段，連接到經(jīng)相同酶切的pHIS2.1載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α，抽提質(zhì)粒用MluⅠ和SpeⅠ雙酶切鑒定，獲得HbFPS啟動(dòng)子誘餌載體pHis-FPS。

1.2.2 酵母單雜交誘餌載體背景表達(dá)抑制劑濃度的篩選 按照MatchmakerTM One-hybrid Library Construction & Screening Kit的操作說(shuō)明，使用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，將誘餌載體pHis-FPS轉(zhuǎn)化到酵母菌株Y187中，將轉(zhuǎn)化液涂布于含不同濃度（0、5、10、20、30、40、60、80、100 mmol/L）3-氨基三唑（3-aminotriazole，3-AT）的酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷性培養(yǎng)基SD/-His/-Trp選擇培養(yǎng)平板上，30 ℃培養(yǎng)5～10 d后，觀察酵母生長(zhǎng)情況。

1.2.3 膠乳總RNA的提取和雙鏈cDNA的合成

橡膠膠乳總RNA的提取參照Tang等[14]的提取方法進(jìn)行。按照polyATtract mRNA Isolation Systems III Kit的操作說(shuō)明分離純化mRNA。應(yīng)用MatchmakerTM One-hybrid Libray Construction & Screening Kit對(duì)所獲得mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到末端含SMARTTM Ⅲ和CDSⅢ接頭的雙鏈cDNA。將獲得的雙鏈cDNA經(jīng)CHROMA SPINTM TE-400樹(shù)脂層析柱（Clontech公司）純化后備用。

1.2.4 cDNA文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞 按照MatchmakerTM One-hybrid Libray Construction & Screening Kit的操作要求，將5 μg誘餌載體質(zhì)粒pHis-FPS、20 μL雙鏈cDNA和3 μg經(jīng)SmaⅠ線性化的融合表達(dá)載體pGADT7-Rec2，用LiAc/PEG法共轉(zhuǎn)化至酵母菌Y187感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞用6 mL 0.9% NaCl溶液重新懸浮，再按1/10、1/100和1/1000的比例分別稀釋，從稀釋液里各取100 μL分別涂布在SD/-Trp、SD/-Leu和SD/-Leu/-Trp平板上培養(yǎng)，用于計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。剩余酵母細(xì)胞懸浮液按100 μL每皿涂布在營(yíng)養(yǎng)缺失培養(yǎng)基SD/-Leu/-Trp/-His/10 mmol/L 3-AT上篩選陽(yáng)性克隆。平板放置30℃培養(yǎng)5～10 d后，觀察酵母生長(zhǎng)情況。

1.2.5 酵母單雜交陽(yáng)性克隆的篩選鑒定 根據(jù)pGADT7-Rec2載體中雙鏈cDNA插入?yún)^(qū)段兩側(cè)序列設(shè)計(jì)一對(duì)上下游引物S1：5′-TTCCACCCAAGCA

GTGGTATCAACGCAGAGTGG-3′和S2：5′-GTATC

GATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3′。選取營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)直徑大于1 mm的酵母菌落進(jìn)行菌落PCR篩選，PCR反應(yīng)體系：在0.2 mL的離心管中加入少量酵母菌落、10×PCR反應(yīng)緩沖液（含MgCl2）2 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、10 μmol/L引物各0.3 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，共30個(gè)循環(huán)。取7 μL PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR鑒定的陽(yáng)性克隆重新在營(yíng)養(yǎng)缺失培養(yǎng)基SD/-Leu/-Trp/-His/10 mmol/L 3-AT上劃線培養(yǎng)，連續(xù)分離3代，通過(guò)酵母菌落PCR的方法選擇出同時(shí)具有文庫(kù)載體和誘餌載體的克隆。

1.2.6 陽(yáng)性克隆序列分析 將鑒定為陽(yáng)性克隆的PCR產(chǎn)物克隆至pMD19T載體上，轉(zhuǎn)至DH5α，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR驗(yàn)證后測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行blastx比對(duì)分析，確定目的基因所編碼的靶蛋白及其生物學(xué)功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbFPS啟動(dòng)子誘餌載體的構(gòu)建

以橡膠樹(shù)基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)約1.1 kb的HbFPS啟動(dòng)子目標(biāo)片段（圖1）。PCR產(chǎn)物連接到pMD19T 載體后用MluⅠ和SpeⅠ雙酶切質(zhì)粒驗(yàn)證，切下約1.1 kb片段，與目標(biāo)帶型大小一致（圖2），陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果與HbFPS啟動(dòng)子序列完全相同，表明HbFPS啟動(dòng)子誘餌載體構(gòu)建成功，命名為pHis-FPS。

2.2 誘餌載體pHis-FPS背景表達(dá)抑制劑濃度的篩選

將誘餌載體pHis-FPS轉(zhuǎn)化到酵母菌株Y187中，在含有不同濃度3-AT的SD/-His/-Trp選擇培養(yǎng)平板培養(yǎng)3～5 d后，觀察發(fā)現(xiàn)3-AT濃度達(dá)到20 mmol/L及以上時(shí)，幾乎沒(méi)有克隆長(zhǎng)出，10 mmol/L時(shí)有少量克隆長(zhǎng)出，5 mmol/L時(shí)長(zhǎng)出克隆較多。又將SD/-His/-Trp選擇培養(yǎng)平板中分別加入4、6、8、10 mmol/L的3-AT再次篩選，結(jié)果顯示3-AT濃度為10 mmol/L時(shí)仍然只有少量克隆長(zhǎng)出（圖3），因此將10 mmol/L的3-AT濃度作為酵母單雜交誘餌載體背景表達(dá)抑制劑濃度。

2.3 酵母單雜交雙鏈cDNA的合成

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的橡膠樹(shù)膠乳總RNA，結(jié)果顯示，總RNA有2條清晰的條帶（圖4），條帶均無(wú)拖尾現(xiàn)象，表明總RNA的提取未發(fā)生降解。紫外分光光度計(jì)測(cè)量樣品OD260/OD280=1.97，濃度為10.13 mg/mL，表明總RNA純度較高。將總RNA分離純化得到mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得末端含SMARTTMⅢ和CDSⅢ接頭的雙鏈cDNA，并純化，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，純化后的雙鏈cDNA片段大小分布在300～2500 bp之間（圖5）。

2.4 酵母單雜交文庫(kù)的構(gòu)建和初步篩選

將純化后的雙鏈cDNA、誘餌載體質(zhì)粒pHis-FPS和線性化的融合表達(dá)載體pGADT7-Rec2，共轉(zhuǎn)化至酵母菌Y187感受態(tài)細(xì)胞中，分別涂布在SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu和SD/-His/-Leu/-Trp/10 mmol/L 3-AT的固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5～10 d后發(fā)現(xiàn)，SD/-Trp、SD/-Leu和SD/-Trp/-Leu平板上均有較多克隆長(zhǎng)出，表明誘餌載體質(zhì)粒pHis-FPS和線性化的融合表達(dá)載體pGADT7-Rec2同時(shí)轉(zhuǎn)入了酵母菌Y187細(xì)胞中。統(tǒng)計(jì)SD/-Trp/-Leu平板上共長(zhǎng)出克隆284個(gè)，2種載體的共同轉(zhuǎn)化效率為1.7×106 cfu/μg。SD/-His/-Leu/-Trp/10 mmol/L 3-AT平板共長(zhǎng)出直徑大于1 mm的酵母菌落45個(gè)。

2.5 陽(yáng)性克隆篩選和基因功能注釋

使用載體特異引物S1和S2對(duì)45個(gè)直徑大于1 mm的酵母菌落進(jìn)行菌落PCR篩選，共36個(gè)克隆擴(kuò)增出清晰條帶，均大于350 bp（空載體引物約300 bp）。其中擴(kuò)增條帶大于1 kb的克隆有12個(gè)，大于750 bp的克隆14個(gè)，大于350 bp的克隆10個(gè)。圖6為部分酵母菌落PCR檢測(cè)結(jié)果。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T載體pMD19T上，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。共測(cè)序36條，除去因特殊結(jié)構(gòu)未測(cè)出序列，共獲得31條可讀序列。

將獲得序列去除載體后，使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blastx工具進(jìn)行同源比對(duì)分析。去除匹配重復(fù)的蛋白序列后，篩選到的蛋白多為功能未知蛋白。經(jīng)過(guò)多次篩選，得到2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列可能與HbFPS啟動(dòng)子序列結(jié)合：一個(gè)序列編號(hào)FPSYOH12，共分離cDNA序列623 bp，推導(dǎo)最大編碼171個(gè)氨基酸，其中2～40 aa預(yù)測(cè)為AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域，blastx比對(duì)結(jié)果顯示，該序列與葡萄中乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子ERF003（登錄號(hào)：XP002285373）同源性為76%（圖7-a）；另一個(gè)序列編號(hào)FPSYOH26，共分離cDNA序列624 bp，推導(dǎo)最大編碼180個(gè)氨基酸，其中9～59 aa預(yù)測(cè)為bHLH類轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域，blastx比對(duì)結(jié)果顯示，該序列與橡膠樹(shù)HbLMYC2 cDNA序列（登錄號(hào)：HM061097）同源性高達(dá)為97%（圖7-b）[15]。

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子作為一種DNA結(jié)合蛋白，通過(guò)與基因啟動(dòng)子區(qū)域中的順式作用元件發(fā)生特異性相互作用，調(diào)節(jié)基因表達(dá)的強(qiáng)度或控制靶基因的時(shí)空特異性表達(dá)，應(yīng)答激素刺激和外界環(huán)境的脅迫，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用。酵母單雜交技術(shù)根據(jù)體內(nèi)DNA結(jié)合蛋白與順式作用元件結(jié)合調(diào)控報(bào)告基因表達(dá)的原理，已成為分離轉(zhuǎn)錄因子的有效手段。本研究將HbFPS的啟動(dòng)子區(qū)段構(gòu)建到酵母單雜交誘餌載體pHIS2.1上，以期獲得能夠調(diào)控HbFPS基因的轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果顯示，筆者初步篩選得到乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子ERF003和bHLH類轉(zhuǎn)錄因子HbLMYC2與HbFPS啟動(dòng)子區(qū)段結(jié)合。ERF轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，是AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子超級(jí)家族中的一個(gè)亞家族，ERF類轉(zhuǎn)錄因子基因受多種植物激素誘導(dǎo)，如乙烯、脫落酸、茉莉酸和水楊酸等，干旱、鹽堿、低溫、病害、機(jī)械損傷等生物與非生物脅迫也會(huì)誘導(dǎo)其表達(dá)。ERF類轉(zhuǎn)錄因子參與植物體內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在植物體的抗逆性調(diào)控中發(fā)揮著不可替代的作用，同時(shí)在調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育中也發(fā)揮著作用[16]。MYC轉(zhuǎn)錄因子家族是bHLH超家族的一種，是植物激素（如茉莉酸、乙烯、脫落酸等）響應(yīng)途徑中的核心轉(zhuǎn)錄因子，具有多種調(diào)節(jié)功能，并廣泛存在與動(dòng)植物中[17]。MYC2是已發(fā)現(xiàn)植物MYC類轉(zhuǎn)錄因子中研究最為深入的一個(gè)，擬南芥MYC2轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)形成COI1/JAZ/MYC2復(fù)合體發(fā)揮調(diào)控作用，參與茉莉酸、脫落酸等植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[18]。最近研究結(jié)果表明，MYC2轉(zhuǎn)錄因子受赤霉素和茉莉酸信號(hào)的協(xié)同調(diào)控，直接激活擬南芥倍半萜合酶基因TPS21和TPS11來(lái)調(diào)控倍半萜的合成和釋放，促進(jìn)擬南芥花中倍半萜的合成[19]。通過(guò)對(duì)HbFPS啟動(dòng)子序列的順式作用元件分析，該區(qū)段含有響應(yīng)乙烯的順式作用元件ERELEE4（AWTTCAAA，-1027）和MYC的順式作用元件（CANNTG，-936）[20-21]，筆者推測(cè)所獲得轉(zhuǎn)錄因子與這些元件結(jié)合，從而響應(yīng)上游轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)對(duì)HbFPS表達(dá)調(diào)控，但具體的結(jié)合元件和調(diào)控機(jī)理還有待進(jìn)一步驗(yàn)證和研究。

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責(zé)任編輯：趙軍明