石平 蔣均紅

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，每年都有大量的口腔材料出現(xiàn)，而材料的生物相容性評(píng)價(jià)是確保材料能否用于人體的最重要因素，在細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)上的細(xì)胞毒性試驗(yàn)作為檢測(cè)生物材料毒性的手段目前已廣泛應(yīng)用于口腔材料的生物相容性評(píng)價(jià)。細(xì)胞毒性試驗(yàn)[1]是運(yùn)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)檢測(cè)醫(yī)療器械和（或）其浸提液可能造成的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、細(xì)胞變異、細(xì)胞溶解、細(xì)胞死亡等影響細(xì)胞正常功能和生物學(xué)行為的作用。該實(shí)驗(yàn)是各種醫(yī)療器械臨床應(yīng)用前安全性評(píng)價(jià)的必選項(xiàng)目和重要指標(biāo)，其特點(diǎn)是能在短期內(nèi)檢出供試品對(duì)細(xì)胞新陳代謝的影響，對(duì)毒性物質(zhì)具有較大的敏感性，試驗(yàn)重復(fù)性好，可以減少不必要的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。本文就細(xì)胞培養(yǎng)及兩種細(xì)胞毒性的評(píng)價(jià)方法綜述如下。

1 細(xì)胞培養(yǎng)的歷史沿革

細(xì)胞生物學(xué)是生命科學(xué)的理論基礎(chǔ)，也是現(xiàn)代生命科學(xué)的前沿科學(xué)，而細(xì)胞培養(yǎng)是其中的重要部分。細(xì)胞培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)[2]，目前細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)各個(gè)領(lǐng)域，是分子生物學(xué)和實(shí)驗(yàn)室生物技術(shù)等的核心實(shí)驗(yàn)室技術(shù)[3]。細(xì)胞培養(yǎng)始于20世紀(jì)初，1907年，Harrison利用懸滴法將分離自青蛙胚胎的神經(jīng)細(xì)胞種植在青蛙的淋巴液中，首次在體外模擬了細(xì)胞的生長(zhǎng)活動(dòng)，為后來(lái)開展體外細(xì)胞研究開辟了新途徑， Harrison也因此被譽(yù)為“細(xì)胞培養(yǎng)之父”[4]。1910年， Burrows在從Harrison實(shí)驗(yàn)室學(xué)習(xí)了這種技術(shù)以后嘗試用雞血漿代替淋巴液培養(yǎng)細(xì)胞并獲成功。此后，Burrows與其外科醫(yī)生出身的同事Alexis Carrel進(jìn)一步致力于哺乳動(dòng)物組織的培養(yǎng)技術(shù)研究。1912年，Alexis Carrel[4]將外科手術(shù)嚴(yán)格的無(wú)菌技術(shù)引入細(xì)胞培養(yǎng)并發(fā)明了專門的細(xì)胞培瓶（Carr-el flask，卡氏培養(yǎng)瓶），顯著改良了Harrison所建立的培養(yǎng)技術(shù)并將其應(yīng)用于成年組織細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)實(shí)踐中，由于此研究成果的重大貢獻(xiàn)，1912年，Alexis Carrel被授予諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理學(xué)獎(jiǎng)，此后Alexis Carrel在體外成功培養(yǎng)了分離自雞胚心臟的心肌細(xì)胞，并將其一直培養(yǎng)到了1946年，證明了體外細(xì)胞不但可以存活而且能傳代增殖。1949年，Alan Parks發(fā)明了-196℃超低溫凍存細(xì)胞的技術(shù)，成為細(xì)胞培養(yǎng)歷史上又一次重大的技術(shù)進(jìn)步。此后，抗生素和胰蛋白酶的出現(xiàn)，也極大地促進(jìn)了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展。1952年，GO Gey[4]成功地培養(yǎng)了人類腫瘤組織并建立至今仍使用的HeLa細(xì)胞系，使細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展到人類組織培養(yǎng)階段。20世紀(jì)80年代，以眾多細(xì)胞系的建立為特點(diǎn)。現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)基本上滲透到到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，隨著培養(yǎng)條件的改善，該技術(shù)也越來(lái)越容易掌握。

2 根據(jù)材料和細(xì)胞接觸方式的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)方法

依據(jù)接觸方式，目前常用的評(píng)價(jià)口腔醫(yī)療器械細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法有以下三種[5]：瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、濾膜擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)、直接接觸實(shí)驗(yàn)。①瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（間接接觸試驗(yàn)）：適用于固體（包括粉末）和液體等試驗(yàn)材料的檢測(cè)，通過(guò)瓊脂糖擴(kuò)散后來(lái)評(píng)價(jià)材料的非特異性細(xì)胞毒性；②濾膜擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)（間接接觸試驗(yàn)）：適用于固體（包括粉末）和液體等試驗(yàn)材料的檢測(cè)，通過(guò)乙酸纖維素濾膜擴(kuò)散后評(píng)價(jià)材料的非特異性細(xì)胞毒性；③直接接觸實(shí)驗(yàn)（包括浸提液試驗(yàn)）：該試驗(yàn)適用于評(píng)價(jià)固體材料和材料浸提液或液體材料的細(xì)胞毒性。

在應(yīng)用直接接觸試驗(yàn)時(shí)，體外培養(yǎng)的細(xì)胞，失去了身體神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間相互作用的影響，生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的相對(duì)穩(wěn)定環(huán)境中，而且其生長(zhǎng)受營(yíng)養(yǎng)條件、生長(zhǎng)空間等因素的限制，所以，Hensten 等[6]認(rèn)為，直接接觸法所得的結(jié)果不能反映材料在口腔內(nèi)實(shí)際的生物相容性，缺乏準(zhǔn)確性。在間接接觸試驗(yàn)中，瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和濾膜擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)利用可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，從而來(lái)檢測(cè)標(biāo)本中各種免疫球蛋白和血清中各種補(bǔ)體成分的含量，敏感性很高。Murray 等[7]研究表明在間接接觸試驗(yàn)中，瓊脂或者濾膜作為屏障用于模擬口腔黏膜，能較為真實(shí)地反映口腔的環(huán)境，但瓊脂類材料和牙本質(zhì)的滲透性還是有很大的區(qū)別[8]，故而間接接觸試驗(yàn)不能有效地反映牙本質(zhì)情況，目前的標(biāo)準(zhǔn)體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)存在一些不足之處，主要原因是試驗(yàn)細(xì)胞與試驗(yàn)材料之間沒(méi)有牙本質(zhì)屏障[9]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)陳志軍等[10]利用人工羥基磷灰石陶瓷片模擬牙本質(zhì)，從而確保牙本質(zhì)通透性的可控性，為口腔材料體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)提供了一個(gè)高效可靠的評(píng)價(jià)方法。

3 生物學(xué)終點(diǎn)評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性的評(píng)價(jià)形式

生物學(xué)終點(diǎn)評(píng)價(jià)形式包括以下五種：

3.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)：主要是觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，該方法是最早用于檢測(cè)細(xì)胞損傷的方法，通過(guò)在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變，可以判斷細(xì)胞是否有污染、是否健康以及增殖情況。在顯微鏡下，通過(guò)觀察裂解細(xì)胞所占的比例來(lái)評(píng)估細(xì)胞毒性級(jí)別，Sujata等[11]研究得出細(xì)胞形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)方法與MTT法等定量細(xì)胞毒性法的Perason相關(guān)系數(shù)為0.9，表明兩者具有良好的相關(guān)性。目前，該方法仍廣泛用于生物材料細(xì)胞毒性的評(píng)價(jià)。

3.2細(xì)胞膜性效應(yīng)評(píng)價(jià)：主要是從細(xì)胞膜的通透性改變方面來(lái)鑒別存活細(xì)胞與死亡細(xì)胞，包括以下兩種試驗(yàn)方法。

3.2.1中性紅攝取試驗(yàn)（NRU）：1986年，Borenfreund等[12]建立中性紅攝取試驗(yàn)，并對(duì)多種材料細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，表明該試驗(yàn)是快速評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性的方法。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO已收錄該檢測(cè)方法，經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）也于2010年將該方法列為細(xì)胞毒性試驗(yàn)預(yù)測(cè)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)起始劑量的指導(dǎo)性文件[13]。

3.2.2乳酸脫氫酶釋放法（LDH 釋放法）：乳酸脫氫酶（LDH）是活細(xì)胞胞漿內(nèi)酶之一，正常情況下，不能透過(guò)細(xì)胞膜。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性改變，LDH可釋放至細(xì)胞外，所以培養(yǎng)基中該酶活性與被裂解的細(xì)胞數(shù)量成正比，采用全自動(dòng)生化分析儀直接檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)板上清液中LDH，可以反映細(xì)胞損傷程度。此方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，用LDH釋放法檢測(cè)腫瘤患者CIK細(xì)胞（細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞）活力，有助于CIK療法適應(yīng)患者的選擇及個(gè)體療效觀察[14]。

3.3細(xì)胞代謝活性評(píng)價(jià)：該方法是通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞生物代謝或生物合成功能的改變來(lái)了解細(xì)胞損傷作用，當(dāng)前，以活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶作為生物學(xué)終點(diǎn)的評(píng)價(jià)方法可以靈敏地反映材料對(duì)細(xì)胞的損害程度[15]。主要包括MTT實(shí)驗(yàn)和XTT實(shí)驗(yàn)。

3.3.1 MTT試驗(yàn)：MTT試驗(yàn)以活細(xì)胞代謝物還原劑3-（4，5）-dimethylthia-hiazo（-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT噻唑藍(lán)為基礎(chǔ)，通過(guò)MTT噻唑藍(lán)作用于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶，生成非水溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，且MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。目前該試驗(yàn)作為材料細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)方法，實(shí)驗(yàn)步驟規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便快速[16-17]，但是在試驗(yàn)過(guò)程的結(jié)晶產(chǎn)物，需要用二甲基亞礬（DMSO）溶解后才能測(cè)定光吸收值，若是溶解不充分，會(huì)影響測(cè)定結(jié)果，從而使得MTT靈敏度略差，因此，楊曉冉等[18]建議MTT法和中性紅攝取試驗(yàn)（NRU）聯(lián)合使用。

3.3.2 XTT試驗(yàn)：XTT試驗(yàn)在MTT的基礎(chǔ)上，省去溶解還原產(chǎn)物結(jié)晶的步驟，1988年，Scudiero等[19]首次采用該方法檢測(cè)細(xì)胞增殖。XTT是一種與MTT類似的四唑氮衍生物，可被活細(xì)胞線粒體脫氫酶還原成水溶性的棕色甲肷產(chǎn)物，當(dāng)XTT與電子偶合劑共同使用時(shí)，甲肷的生成量與細(xì)胞的增殖程度呈正相關(guān)。該試驗(yàn)方法較MTT 法具有顯著優(yōu)點(diǎn)，已被納入國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO10993-5：2009中，但XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用，成本較高。

3.4細(xì)胞增殖率評(píng)價(jià)：主要是觀察材料或材料浸提液與細(xì)胞接觸后細(xì)胞生長(zhǎng)速度和增殖的變化，主要有克隆形成試驗(yàn)。最早由Tuchiya提出，用克隆形成率（實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)/對(duì)照組克隆數(shù)）來(lái)評(píng)價(jià)材料的細(xì)胞毒性。Tuchiya等[20]研究表明，克隆形成試驗(yàn)較分子濾過(guò)法、瓊脂覆蓋法、中性紅攝取法更為敏感，目前該方法已收錄在國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 10993-5：2009中。

3.5 DNA合成率檢測(cè)評(píng)價(jià)：通過(guò)測(cè)定有絲分裂的細(xì)胞數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖能力，主要有5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）滲入法和胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）滲入法。敏感性很高，但重復(fù)性略差[21]。

綜上所述，評(píng)價(jià)材料的體細(xì)胞毒性的試驗(yàn)方法較多，而由于不同材料接觸方式及毒理不一，各試驗(yàn)方法之間又存在很大的敏感差異。因此，Weyermann等[22]提倡在選擇試驗(yàn)方法時(shí)，必須根據(jù)“最接近應(yīng)用狀況”的原則，合理地選擇樣品與細(xì)胞的接觸方式和檢測(cè)生物學(xué)終點(diǎn)的評(píng)價(jià)方法。

[參考文獻(xiàn)]

[1]GB/T 16886.5-2003 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)[S].北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社出版，2003.

[2]司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)[M].北京：世界圖書出版公司，2007：10.

[3]Mozdziak PE，Petitte JN，Carson SD.An introductory under graduate coursecovering animal cell culture technique-es[J].Biochem Mol-Biol Educ，2004，32（5）：319-322.

[4]劉玉琴.細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2009：4-6.

[5]GBT 16886.10-2005醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)[S].北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社出版，2005.

[6]Hensten N.Comparison of the method-s available for assessing cyto：toxicit-y[J].Int Endod J，1988，21：89-99.

[7]Murray PE，Garcia Godoy C，GarclaG-odoy F.How is the biocom-patibilty of dental biomaterials evaluated[J].Med Oral Patot Oral Cir Bucal，2007，12（3）：258-266.

[8]Schmalz G.The agar overlay method[J].Int Endod J，1988，21：59-66.

[9]趙信義.現(xiàn)行體外試驗(yàn)評(píng)價(jià)牙齒修復(fù)材料細(xì)胞毒性的優(yōu)勢(shì)與不足[J].口腔醫(yī)療器械，2009，18（4）：173-175.

[10]陳志軍，江昕，陳芳，等.多孔生物陶瓷制備工藝進(jìn)展[J].生物骨科材料與臨床研究，2008，5（1）：49-52.

[11]Sujata K，Bhatia A，Yetter B.Correl-ation of visual in vitro cytotoxicity rat-ings of biomaterials with quantitative in vitro cell viability measurements[J].Cell Biol Toxicol，2008，24：315-319.

[12]Borenfreundand E，Puerner JA.Cytotoxici-ty of metals， metal-metal and metalch-elator combinations assayed invitro[J].Toxicology，1986，39（2）：121-134.

[13]OECD.Guidance document on using cytotoxicity tests to estimate starting d-oses for acute oral system toxicity te-st[R].Paris：Organisation for Econo-mic Cooper ation and Development，2010.

[14]張蕾，李芳秋，張士，等.LDH釋放法檢測(cè)腫瘤患者PBMC和CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008，23（6）：27-29.

[15]林紅賽，王春仁，王志杰，等.生物材料的細(xì)胞生物相容性評(píng)價(jià)方法的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)療器械信息，2011，17（4）：10-14.

[16]Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：Application to proliferation and cytotoxicity assays[J].J Immun Meth，1983，65（1）：55-63.

[17袁艷波.牙科生物材料細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法的研究進(jìn)展[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2009，26（3）：688-691.

[18]楊曉冉，鄭洪艷，董益陽(yáng).兩種3T3光毒性試驗(yàn)方法在防曬化妝品光毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，19（34）：6765-6768.

[19]Scudiero DA，Shoemaker RH，Paull KD，et al.Evaluation of asoluble tetr-azoliu-m/formzan assay for cell growt-h and drug sensitivity in culture usin-g human and other tumor cell lines[J].Cancer Research，1988， 48（17）：4827-4833.

[20]Tsuchiya T，Ikarashi Y，Hata H，et al. Comparative studies of the toxicity o-f standard reference materials in vari-ous cytotoxicity tests and in vivo imp-lantation tests[J].J of Applied Biomaterials，1993，4：153-156.

[21]章靜波.細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001：200-203.

[22]Jorg W，Dirk L， Chr-istiane G，et al. Albumin- prota-mine-oligonucleotide-nanoparticles as a new antisensedelivery system. Part 2：cellular uptake andeffect[J]. European J of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2005，59（3）：431-438.

[收稿日期]2014-05-26 [修回日期]2014-06-19

編輯/李陽(yáng)利