孫雪等

摘 要：平貝母為一味傳統(tǒng)中藥，但其產(chǎn)量卻受繁殖系數(shù)低等因素限制。因而為篩選出平貝母鱗莖再生的最佳離體培養(yǎng)體系，本文分別研究了外植體種類，激素的不同濃度和組合以及光照對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響和不定芽再生的影響。

關(guān)鍵詞：平貝母 愈傷組織 不定芽

Callus Induction of Fritillaria ussuriensis and plant regeneration

SUN Xue XU Yuan Sun Chun yu Jiang Shi Cui Wang Kang Yu ZHANG Mei Ping WANG Yi

（Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

Abstract：Fritillaria ussuriensis is traditional Chinese medicine，but its production has limitations of low propagation coefficient.To filter out the best regeneration system of Fritillaria bulbs in vitro culture.This paper studies the kinds of explants，hormones has different concentrations and combinations，and light have effect on callus induction and bud regeneration.

Key words：Fritillaria ussuriensis Maxim；Callus；Adventitious buds.

平貝母（Fritillaria ussuriensis Maxim）為我國中醫(yī)學(xué)中常用的一味非常重要的藥用植物。其味甘補(bǔ)肺，入藥后能夠止咳化痰抗炎，是祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中非常重要的一味中藥，因其良好的醫(yī)療效果，其市場(chǎng)需求量很大。但平貝母本身具有兩次生長兩次休眠的特性，因而生長緩慢，達(dá)到商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)需要幾年的時(shí)間。平貝母多生長在高寒地帶，其繁殖系數(shù)低，田間管理費(fèi)時(shí)費(fèi)力，故而產(chǎn)量很低[1-2]。平貝母的快繁技術(shù)在提高其產(chǎn)量上起著非常重要的作用。目前在貝母屬植物中關(guān)于暗紫貝母、浙貝母、平貝母、伊貝母、和川貝母[3-7]的快繁技術(shù)均有報(bào)道。本文分別以平貝母的頂芽、莖段、葉片為外植體，再分別添加相應(yīng)濃度的2，4-D、BA、KT、NAA獲得再生植株，又利用正交試驗(yàn)的方式進(jìn)而確定愈傷組織的誘導(dǎo)體系和植株的再生體系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料均取自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園種植的平貝母（2～4年生）3月中旬至4月中旬的頂芽、莖和葉片。

1.2 方法

1.2.1 外植體的處理：所有實(shí)驗(yàn)材料均用用酒精（70%）進(jìn)行消毒，時(shí)間為30s，消毒后用無菌水進(jìn)行沖洗3～5次（1～2min/次），再用升汞（0.1%）消毒8～10min后，用無菌水沖洗3-5次，1～2min/次。葉片切成規(guī)格為0.4～0.5cm2的塊，莖、頂芽切成段規(guī)格為1cm的段。培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，其成分為蔗糖3%，瓊脂0.65%。

1.2.2 平貝母最優(yōu)培養(yǎng)體系的建立

將處理好的平貝母莖段、葉片、頂芽，分別接種到準(zhǔn)備好的MS固體培養(yǎng)基中，定期觀察記錄生長狀況，并對(duì)愈傷組織及不定芽的誘導(dǎo)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)材料的影響：2，4-D、BA、NAA、KT四種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)進(jìn)行不同濃度組合后，分別對(duì)培養(yǎng)材料進(jìn)行處理，分析各物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)材料生長、分化的影響，以長勢(shì)和生物量的水平來確立最適濃度和種類。

光照對(duì)培養(yǎng)物的影響：取黑暗、弱光、強(qiáng)光等三個(gè)光照條件，觀察光對(duì)培養(yǎng)材料的影響。其中光強(qiáng)分別為1000Lx和2000Lx，光周期為16h/d。

1.2.3 試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法：平貝母愈傷組織誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)愈傷組織數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；平貝母不定芽誘導(dǎo)率=形成芽的塊數(shù)/外植體塊數(shù)×100%；平貝母不定芽分化率=分化綠點(diǎn)的愈傷組織塊數(shù)/接種愈傷組織塊數(shù)×100%；平貝母鱗莖誘導(dǎo)率=形成鱗莖的愈傷組織塊數(shù)/接種愈傷組織塊數(shù)×100%。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 平貝母愈傷組織的誘導(dǎo)

2.1.1 外植體對(duì)平貝母愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表1為不同外植體對(duì)平貝母愈傷組織的誘導(dǎo)效果，從表1中可以看出，平貝母不同種類外植體愈傷組織的誘導(dǎo)率差異較大。其中，誘導(dǎo)率最高的為莖段，達(dá)到77.5%，而葉片的誘導(dǎo)率為10%。

2.1.2 不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

為了研究2，4-D、BA、KT和NAA四種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的不同濃度配比后對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，本文進(jìn)行了L16（44）正交試驗(yàn)。各種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的因素和水平均如表2所示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，每個(gè)實(shí)驗(yàn)的樣本數(shù)大于30個(gè)。

表3為添加4種不同濃度激素后的正交實(shí)驗(yàn)方差與實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從表中可知平貝母愈傷組織的誘導(dǎo)率因生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度不同有差異，可以得出RA>RC>RD>RB，因而2，4-D是愈傷組織誘導(dǎo)過程中的主要影響因素。相比之下KT、NAA和BA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響較小。能夠使愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到最高的激素組合為A3、B4、C3、D1，即2，4-D濃度為2.5mg/L。

2.1.3 光照對(duì)平貝母愈傷組織的影響

表5為光照對(duì)培養(yǎng)材料的影響，從表中可以看出光照和黑暗條件下均能獲得平貝母的愈傷組織。黑暗條件下平貝母愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，并且愈傷組織呈黃色，較松散，脫分化速度較快；強(qiáng)光下平貝母愈傷組織的誘導(dǎo)率最低，愈傷組織呈淺綠色，質(zhì)地密，脫分化速度慢。

2.2 平貝母器官發(fā)生的誘導(dǎo)

2.2.1 平貝母不定芽的誘導(dǎo)

表6為平貝母不同部位外植體不定芽的誘導(dǎo)效果。由表可以看出不同外植體不定芽誘導(dǎo)率差異較大。其中誘導(dǎo)率最高的為頂芽外植體，其誘導(dǎo)率為75%；莖段外植體的不定芽誘導(dǎo)率為60%；葉片的誘導(dǎo)率最低僅為12.5%。

2.2.2 植物激素種類和濃度對(duì)平貝母芽分化的影響

為了研究BA、NAA和2，4-D對(duì)平貝母不定芽誘導(dǎo)的影響，本實(shí)驗(yàn)采用L9（33）正交試驗(yàn)。各因素和水平均如表7所示，試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)實(shí)驗(yàn)的樣本數(shù)大于30個(gè)。

表8表9為添加不同激素后正交試驗(yàn)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差數(shù)據(jù)。從表中可知三種激素對(duì)平貝母不定芽誘導(dǎo)率產(chǎn)生影響的主次順序?yàn)镹AA>BA>2，4-D，也可得出NAA0.5mg/L、BA 1.0mg/L的組合是誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生的最佳激素。

2.2.3 光照對(duì)不定芽分化增殖的影響

表10為光照對(duì)平貝母不定芽分化增殖的影響。由表中可以看出，在黑暗條件下，增殖系數(shù)最高的為不定芽。而在強(qiáng)光下不定芽的生長系數(shù)最高，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，強(qiáng)光下的培養(yǎng)物中愈傷組織的部分會(huì)出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。而弱光下的組織則生長狀態(tài)良好。因而，黑暗條件有助于平貝母不定芽的增殖，而強(qiáng)光條件則會(huì)使不定芽生長、成苗的速度加快。

3 討論

影響體胚的發(fā)生和發(fā)育的一個(gè)重要因素是植物離體培養(yǎng)的條件，而這個(gè)條件包括外部條（如培養(yǎng)基種類、光照與否、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度和種類）和內(nèi)部條件（如外植體的取材部位和取材時(shí)間）。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，平貝母的莖段適宜誘導(dǎo)胚性愈傷組織，誘導(dǎo)率可達(dá)77.5%，而葉片的誘導(dǎo)率較低只有10%。這與袁藝[8]等報(bào)道的浙貝母葉片誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)率為10%～13.3%一致，這說明平貝母愈傷組織的誘導(dǎo)率與外植體取材部位有關(guān)。莖段的誘導(dǎo)率較高的原因可能是由于接種后莖段膨大、開裂，而愈傷組織較易在傷口處形成。葉片接種后雖也有膨大、和邊緣卷曲現(xiàn)象，由于其分化程度較高，在接種后較難進(jìn)入脫分化過程，因此只有較少部分在邊緣長出黃色愈傷團(tuán)。并且由于品種不同，培養(yǎng)條件也不同，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可能存在出現(xiàn)微小差異。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果還表明不管是強(qiáng)光還是弱光都在一定程度上抑制了愈傷組織的產(chǎn)生和生長，這可能與光照條件下植物組織會(huì)在不同程度上形成已分化狀態(tài)的維管組織有關(guān)。實(shí)驗(yàn)中由不同外植體直接誘導(dǎo)不定芽時(shí)發(fā)現(xiàn)，頂芽的誘導(dǎo)效率最高為75%，這個(gè)結(jié)果高于莖段和葉片的誘導(dǎo)率60%和12.5%，這與王躍華（2010）等的川貝母葉片的鱗莖誘導(dǎo)率32%不完全一致，出現(xiàn)這樣的結(jié)果可能與頂芽屬于植物的頂端分生組織，生長活躍，頂芽內(nèi)的激素的種類和水平與莖段和葉片內(nèi)的都不同有關(guān)。在植物組培過程中，外源激素必須通過外植體中的內(nèi)源激素發(fā)揮作用[9]。而本實(shí)驗(yàn)中不定芽誘導(dǎo)過程中頂芽的誘導(dǎo)效率最高，這可能是由于頂芽中的內(nèi)源激素和培養(yǎng)基中添加的外源激素共同作用后，促使激素水平更有利于不定芽的產(chǎn)生。

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