王東艷

【摘 要】愈傷組織細(xì)胞分裂快、結(jié)構(gòu)疏松、具有快速的增殖能力等特點(diǎn)，已成為植物快繁的新手段，最常用的植物組織培養(yǎng)形式。本文主要對(duì)愈傷的特點(diǎn)以及影響植物愈傷組織形成的條件內(nèi)源激素和外源激素、光照條件、溫度條件、培養(yǎng)基的成分等進(jìn)行簡(jiǎn)要的概述。

【關(guān)鍵詞】愈傷組織；組織特點(diǎn)；影響條件

愈傷組織是指外植體在離體培養(yǎng)條件下形成的一團(tuán)無(wú)極性、能旺盛分裂的薄壁細(xì)胞團(tuán)，在培養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化可以發(fā)育成完整的再生植株。愈傷組織培養(yǎng)已成為一種最常用的植物組織培養(yǎng)形式，其不僅是一種植物快繁的新手段，同時(shí)也是植物改良，種質(zhì)保存和有用化合物生產(chǎn)的理想途徑，在生產(chǎn)實(shí)踐中得到廣泛應(yīng)用。因此，不斷深入研究影響植物愈傷組織形成和誘導(dǎo)的因素，不僅可以促進(jìn)植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展和完善，而且可以為實(shí)踐應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 愈傷組織特點(diǎn)

植物的愈傷組織一般具備以下3種特點(diǎn)：首先，具有高度再分化和長(zhǎng)期繼代保存的能力，以便能夠獲得再生的植株。其次，可輕易破碎，以便形成良好的植物組織的懸浮系， 而且可以分離出所需要的原生質(zhì)體。再次，具有快速的增殖能力，因此容易形成豐富的愈傷組織系?；谥参镉鷤M織具有的以上特征，植物可通過(guò)愈傷組織進(jìn)行多種多樣的遺傳操作和分析及其對(duì)瀕危藥用植物資源、植物遺傳轉(zhuǎn)化等方面發(fā)揮重要的作用[1-2]。

2 影響愈傷組織的條件

植物愈傷組織的形成受多種條件的影響，例如植物的內(nèi)源激素和外源激素、光照條件、溫度條件、培養(yǎng)基的成分等均可以影響植物愈傷組織的形成。

2.1 激素對(duì)植物愈傷組織的影響

20世紀(jì)初期溫特發(fā)現(xiàn)了首個(gè)內(nèi)源激素即生長(zhǎng)素，開(kāi)辟了植物體中內(nèi)源激素的探索道路。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行發(fā)現(xiàn)的植物內(nèi)源激素越來(lái)越多，其作用越來(lái)越受人們的關(guān)注。植物內(nèi)源激素是指由植物自身代謝產(chǎn)生，可以自由移動(dòng)到作用部分起功能的一類微量有機(jī)物質(zhì)，在極低濃度下就有明顯生理效應(yīng)，也被稱為植物天然激素或植物激素[3-4]。雖然植物體中內(nèi)源激素的含量很低， 但它們與植物生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)， 影響植物生命活動(dòng)的整個(gè)過(guò)程。植物激素是愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中的重要影響因子， 能夠誘導(dǎo)細(xì)胞分裂的啟動(dòng)、愈傷組織的形成和生長(zhǎng).這些植物內(nèi)源激素在細(xì)胞分裂與伸長(zhǎng)、組織與器官分化、開(kāi)花與結(jié)果、成熟與衰老、休眠與萌發(fā)以及離體組織培養(yǎng)過(guò)程中，相互協(xié)調(diào)地調(diào)控植物的生長(zhǎng)、發(fā)育與分化[5-6]。在植物愈傷組織培養(yǎng)中， 外源激素對(duì)它的影響主要是把信號(hào)傳給內(nèi)源激素調(diào)控遺傳物質(zhì)的脫分化、再分化等作用， 因此外源激素的作用效果與愈傷組織本身內(nèi)源激素的種類和水平有密切關(guān)系，外源激素必須通過(guò)內(nèi)源激素才能發(fā)揮其作用[7]。例如，低濃度的2.4-D 的NB培養(yǎng)基能誘導(dǎo)產(chǎn)生秈稻的愈傷組織，但是愈傷組織比較松軟， 呈黏液化和泡狀， 一般不易分化， 且再生頻率很低。只有將各種外源激素合理使用， 才能適應(yīng)外植體對(duì)激素的特定要求， 充分發(fā)揮激素的調(diào)節(jié)作用， 誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生并達(dá)到分化[8-9]。植物愈傷組織的培養(yǎng)離不開(kāi)植物組織培養(yǎng)。植物組織培養(yǎng)是在含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及植物生長(zhǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)離體植物組織（器官或細(xì)胞）并誘導(dǎo)使其長(zhǎng)成完整植株的技術(shù)。在組織培養(yǎng)中， 通過(guò)器官發(fā)生途徑產(chǎn)生再生植株的基本方式一般有3 種：（1）先分化芽， 芽伸長(zhǎng)后在其幼莖基部長(zhǎng)根， 形成完整的小植株. 這種方式在木本植物培養(yǎng)中較為普遍。（2）先分化根， 再在根上產(chǎn)生不定芽而形成完整植株。（3）在愈傷組織的不同部位分別形成芽和根， 然后二者的維管組織互相連接， 成為有軸狀結(jié)構(gòu)的小植株。在培養(yǎng)基中如果存在腺嘌呤或激動(dòng)素， 就會(huì)促進(jìn)芽的分化和發(fā)育，激動(dòng)素的效力比腺嘌呤大幾萬(wàn)倍.在結(jié)合使用IAA（ 或NAA） 和BA（ 或KT） 時(shí)，IAA（ 或NAA） 的相對(duì)濃度較高， 則有利于細(xì)胞的增殖和根的分化， 若BA（ 或KT） 的相對(duì)濃度較高， 則促進(jìn)芽的分化，如果比例適中時(shí)， 則仍產(chǎn)生無(wú)分化的愈傷組織[11]。

2.2 基因?qū)χ参镉鷤M織的影響

植物愈傷組織器官的發(fā)生主要是相應(yīng)基因表達(dá)和相應(yīng)蛋白的合成過(guò)程。植物愈傷組織在植物激素和其他生長(zhǎng)條件的影響下，可通過(guò)各種信號(hào)傳遞系統(tǒng)調(diào)節(jié)器官發(fā)生有關(guān)的基因的活性、啟動(dòng)器官發(fā)生有關(guān)基因的表達(dá)、產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白，進(jìn)而在促進(jìn)愈傷組織的形成中發(fā)揮重要的作用[10]。愈傷組織中表達(dá)蛋白的多少可反映其組織化和分化的程度， 表達(dá)的蛋白少， 表明該愈傷組織的分化或組織化程度低， 具有較強(qiáng)的分生能力或器官發(fā)生能力[12]，例如，在大麥愈傷組織形成時(shí)被檢測(cè)出約30個(gè)特異性表達(dá)的蛋白[13]。

2.3 培養(yǎng)基對(duì)植物愈傷組織的影響

植物愈傷組織的形成主要的介質(zhì)為培養(yǎng)基，也是愈傷組織成功的必要條件，目前植物愈傷組織的培養(yǎng)基主要分為MS、H、B5、N6、White等5類培養(yǎng)基， 每種培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分、鹽濃度不同。不同的植物愈傷組織培養(yǎng)基也有所不同。研究發(fā)現(xiàn)，豆科類愈傷組織一般使用MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)較好[14]，而在N6培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)受到明顯的抑制。pH值與多種培養(yǎng)基的凝固相關(guān)聯(lián)，pH直接反應(yīng)了培養(yǎng)基的酸堿度，同時(shí)也直接或間接的影響植物愈傷組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，所以要精確控制植物愈傷組織培養(yǎng)基的pH值。培養(yǎng)基的pH值根據(jù)不同的培養(yǎng)材料有所不同，一方面，適當(dāng)降低培養(yǎng)基pH 值可以降低多酚氧化酶的活性和底物利用率， pH越接近6.0越有利于愈傷組織的形成。另一方面，有些植物材料愈傷組織培養(yǎng)基要求的pH與正常相比較高一些，基本呈現(xiàn)出中性的狀態(tài)[15]。除了pH值的影響外，碳源也是影響植物愈傷組織形成的重要因素之一。植物愈傷組織的培養(yǎng)基不能缺少碳源，碳源能夠給外植體提供能量， 而且具有調(diào)節(jié)滲透平衡的作用.絕大多數(shù)的培養(yǎng)基都用蔗糖作為主要的碳源，能夠保證絕大多數(shù)植物離體培養(yǎng)物的正常生長(zhǎng)， 蔗糖一直被作為植物組織培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)的碳源得到廣泛應(yīng)用.許多研究表明， 另外與pH值的影響類似，不同植物對(duì)不同糖類的反應(yīng)也是不完全相同[16]。

2.4 光照對(duì)植物愈傷組織的影響

光照條件時(shí)影響植物愈傷組織形成的一個(gè)重要的影響因子。光照和黑暗培養(yǎng)條件對(duì)植物愈傷組織的影響表現(xiàn)的截然不同， 研究發(fā)現(xiàn)，光照條件下， 長(zhǎng)春花組織培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因主要在于光照在誘導(dǎo)分化時(shí)可激活某些酶的活性和光誘導(dǎo)的葉綠體或葉綠體代謝產(chǎn)物。同樣也有研究報(bào)道顯示黑暗對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)是有利的。多數(shù)植物細(xì)胞在光照和黑暗培養(yǎng)條件下合成的次生代謝物的含量有較大的差別，影響著植物愈傷組織培養(yǎng)時(shí)次生代謝產(chǎn)物的積累。

2.5 溫度對(duì)植物愈傷組織的影響

植物愈傷組織誘導(dǎo)和次生代謝物形成很大程度上受溫度的影響，植物愈傷組織的培養(yǎng)適宜生長(zhǎng)的溫度范圍一般為15 ～ 32℃，不同植物的愈傷組織的最適溫度有所不同，例如，擬南芥最適培養(yǎng)溫度一般為23℃，而矮牽牛最適培養(yǎng)溫度一般為25℃。但是次生代謝物形成的最適溫度往往與形成愈傷組織的最適溫度不同[17]。

上述的討論表明， 內(nèi)源激素和外源激素、光照條件、溫度條件、培養(yǎng)基的成分是影響植物愈傷組織誘導(dǎo)和分化的幾種重要的因素。 盡管其作用特點(diǎn)已知， 但由于植物物種的差異， 植物內(nèi)源激素和外源激素以及培養(yǎng)基種類的選擇和使用量，光照條件和溫度條件的選擇成為探討高效率進(jìn)行植物愈傷組織誘導(dǎo)和分化的關(guān)鍵所在。植物內(nèi)源激素對(duì)植物的生長(zhǎng)和代謝有重要作用，但在植物體內(nèi)的含量極低且性質(zhì)不穩(wěn)定，因此對(duì)植物內(nèi)源激素進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析是一項(xiàng)艱巨而意義重大的任務(wù)。目前愈傷組織培養(yǎng)激素的添加有多種組合方式使植物愈傷組織的培養(yǎng)呈現(xiàn)出更加多樣化的形式，在培養(yǎng)基中添加多種激素的例子越來(lái)越多， 有關(guān)愈傷組織培養(yǎng)中激素影響方面的研究趨于細(xì)致化。由于不同種植物愈傷組織的誘導(dǎo)溫度和光照時(shí)間有所不同，選擇適宜的光照和溫度也成為愈傷組織培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵所在，同時(shí)對(duì)愈傷組織培養(yǎng)具有重要的指導(dǎo)意義。近幾年隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，利用分子生物學(xué)技術(shù)研究植物組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)在的研究熱點(diǎn)內(nèi)容之一。通過(guò)構(gòu)建相應(yīng)的植物激素相關(guān)基因的突變體調(diào)控激素相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物數(shù)量便于研究植物愈傷組織誘導(dǎo)和分化與激素相關(guān)基因調(diào)控的關(guān)系。而應(yīng)用同位素標(biāo)記技術(shù)可以對(duì)激素的作用位點(diǎn)進(jìn)行精確定位， 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)組織培養(yǎng)過(guò)程的每個(gè)發(fā)育細(xì)節(jié)微觀上的診斷， 達(dá)到有效選擇激素種類、靈活改變繼代周期的目的， 也必將促使組織培養(yǎng)技術(shù)更為完善。

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