吳峰+黃燕芬+曹永高+劉向陽+朱守引+任佳欣

摘 要：以百蕊草的幼嫩莖及葉片為外植體，探討百蕊草外植體的最佳消毒時間、離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基適宜配方、pH值以及培養(yǎng)溫度。結(jié)果表明，最佳消毒時間為酒精消毒11 s后升汞消毒8 min；愈傷組織誘導(dǎo)增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+1 mg·L-1 6-BA+0.15 mg·L-1 NAA+0.1 mg·L-1 2，4-D；最適pH值為5.8～6.0；最佳培養(yǎng)溫度為22～26 ℃。

關(guān)鍵詞：離體培養(yǎng)；愈傷組織；影響因素

中圖分類號：Q945 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.11.004

Abstract： Taken the tender branches and Leaves of Thesium Chinese Turcz as explants， the best method for sterilization of explants，best medium and culture conditions for callus induction were instigated on callus by using the orthogonal experiments. The results showed that the best disinfection for alcohol after was 11 s and mercuric chloride disinfection was 8 min， the best medium for induction of callus was MS + 1 mg·L-1 6-BA+0.15 mg·L-1 NAA +0.1 mg·L-1 2，4-D， the optimal pH was 5.8～6.0， and the best culture temperature was 22～26 ℃.

Key words： in vitro culture； callus； factors affecting

百蕊草（Thesium Chinense Turcz）為檀香科植物，別名百乳草、小草、地石榴等[1]， 始載于《圖經(jīng)本草》，味辛，微苦，性寒，歸肺、脾、腎經(jīng)。全草入藥具有清熱解毒，補(bǔ)腎澀精之功效，多用于治療各種炎癥，如急性乳腺炎、肺炎、咽炎、肺膿腫、淋巴結(jié)結(jié)核等疾病[2-4]。百蕊草為多年生寄生草本植物，根上有寄生根， 常附著在其他活體植物根上而生長[5-6]，所以，人工種植比較困難，到目前為止還沒有進(jìn)行規(guī)模化種植。通過組織培養(yǎng)的方法，在人工控制條件下快速繁殖愈傷組織，并建立百蕊草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系，生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物具有重要意義。

本研究的目的在于優(yōu)化和完善百蕊草愈傷組織培養(yǎng)技術(shù)，為進(jìn)一步通過細(xì)胞懸浮培養(yǎng)規(guī)模化生產(chǎn)百蕊草苷等次生代謝物提供穩(wěn)定高產(chǎn)細(xì)胞系。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為野生的百蕊草幼嫩莖和葉片，采自貴州省貴陽市花溪區(qū)。

1.2 試驗(yàn)方法

通過控制變量和正交試驗(yàn)的方法，用新鮮百蕊草植株經(jīng)消毒處理后接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)觀察一段時間后，分析對比并找出誘導(dǎo)百蕊草愈傷組織的培養(yǎng)基配方中細(xì)胞分裂素6-BA和生長激素NAA、2，4-D用量的最好配比；探究百蕊草外植體的最佳消毒時間、培養(yǎng)基pH值、培養(yǎng)溫度；通過連續(xù)幾周的觀察，對比分析確定正交試驗(yàn)組中最有利于百蕊草愈傷組織分化培養(yǎng)的激素配比，再利用確定的最好配方進(jìn)行百蕊草愈傷組織的擴(kuò)大培養(yǎng)，以獲得大量愈傷組織用于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系的建立。

1.2.1 百蕊草愈傷組織的誘導(dǎo)與初代培養(yǎng) 取新鮮幼嫩、健壯的外植體，用自來水沖洗干凈后，用75%酒精浸泡10 s，無菌水清洗2次。再用0.1%的升汞溶液消毒5 min，無菌水浸洗3次，用無菌水浸泡10 min，用無菌水洗2次。最后將枝條和葉片剪成約1.0 cm長的小段，接種于1/2 MS+1 mg·L-1 6-BA+0.4 mg·L-1 NAA+0.1 mg·L-1 2，4-D愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)14 d百蕊草葉片漸漸分化變厚變粗，30 d后便形成綠色塊狀愈傷組織。

1.2.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化 選取植株上的幼嫩、健壯無病蟲害的莖和葉作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織。將初代誘導(dǎo)分化形成的愈傷組織切成0.5～0.8 cm2大小轉(zhuǎn)接在培養(yǎng)基中，置于同一光照培養(yǎng)箱下培養(yǎng)觀察記錄，以篩選最好的誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基配方。

培養(yǎng)基配方篩選采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)（表1），并控制pH值，光照培養(yǎng)箱溫度、光照時間（10～12 h·d-1），光照強(qiáng)度（1 500～1 800 lx）一致。觀察、對比分析，得到較為準(zhǔn)確的培養(yǎng)愈傷組織的培養(yǎng)基配方，再用較好的培養(yǎng)基配方分別以pH值或溫度為自變量，來確定培養(yǎng)百蕊草愈傷組織最佳的培養(yǎng)基pH值或光照培養(yǎng)箱溫度。

1.2.3 外植體表面消毒時間對外植體消毒效果的影響 從植株上取具4～5片葉，長約6 cm的新生幼嫩枝條，用自來水清洗干凈后置于超凈工作臺上，設(shè)置75%酒精浸泡消毒8，9，10，11，12 s，0.1%的升汞溶液滅菌8 min及75%酒精浸泡消毒11 s，0.1%的升汞溶液滅菌6，7，8，9，10 min。每次無菌水浸洗3次后浸泡5 min，然后將葉片切成2段、枝條剪成帶有腋芽約1.0 cm長的小段，接種于表1的C2培養(yǎng)基中。

1.2.4 不同培養(yǎng)條件對愈傷組織生長的影響

（1）不同pH值對誘導(dǎo)愈傷組織生長的影響。按篩選出的C2配方MS+1 mg·L-1 6-BA+0.15 mg·L-1 NAA+0.1 mg·L-1 2，4-D配制培養(yǎng)基。設(shè)置pH值梯度為5.2，5.4，5.6，5.8，6.0。將長勢較好的愈傷組織塊切成0.5～0.8 cm2大小接入培養(yǎng)基中，相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)觀察記錄，以篩選百蕊草愈傷組織生長培養(yǎng)基的最佳pH值。