劉義存　黃天啟

摘 要：通過(guò)對(duì)外界環(huán)境如溫度、光照等條件對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響研究。結(jié)果：葉片培養(yǎng)在溫度22℃時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)的效果最好，可達(dá)到81.82%；有經(jīng)過(guò)10 d黑暗培養(yǎng)處理的葉片，愈傷誘導(dǎo)率整體有明顯提高；在最適溫度和黑暗培養(yǎng)處理下，培養(yǎng)基配方為MS+BA 0.2 mg·L-1+KT 0.2 mg·L-1+2，4-D 1.0mg·L-1，櫟葉枇杷葉片的愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到100%。

關(guān)鍵詞：櫟葉枇杷；葉片；愈傷組織；誘導(dǎo)

中圖分類號(hào)：S667.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20161131005

枇杷屬植物（EriobotryaLindl.），屬薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae），分布于我國(guó)南部或東南亞地區(qū)的亞熱帶常綠樹(shù)種，全世界枇杷屬植物約有 30 個(gè)種或變種[1]，其中大部分都處于野生狀態(tài)。野生枇杷蘊(yùn)含豐富的遺傳多樣性，還具有一些可以用于栽培枇杷遺傳改良的重要性狀，如抗病蟲(chóng)、抗逆、抗倒伏等。野生枇杷與栽培枇杷不存在生殖隔離，容易通過(guò)常規(guī)育種或者生物技術(shù)手段將這些優(yōu)良性狀漸滲到栽培枇杷中去，使栽培枇杷不僅可獲得優(yōu)良性狀，同時(shí)也拓寬遺傳背景[2，3]。此外，野生枇杷還是優(yōu)良砧木資源。關(guān)于枇杷胚、莖尖、胚乳、原生質(zhì)體的離體培養(yǎng)均有不少研究，但關(guān)于葉片愈傷組織的研究，在栽培枇杷上尚有若干報(bào)道[4-7]，在野生枇杷上則鮮有報(bào)道。本文對(duì)櫟葉枇杷的葉片誘導(dǎo)愈傷做了研究，旨在尋找最佳愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方以及培養(yǎng)條件，為下一步誘導(dǎo)胚、離體保存乃至形成新的植株提供一定的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料選取

以櫟葉枇杷（E.prinoidesRehd.andWils）組培苗的葉片為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 處理方法

取組培苗中成熟新鮮的葉片，在超菌工作臺(tái)中切成大小約為0.5cm×0.5cm的小塊，并迅速接種到相應(yīng)的培養(yǎng)基中。接種時(shí)，葉片背向下，與培養(yǎng)基充分接觸。整個(gè)過(guò)程控制在10～15 min一組。所有處理暗培養(yǎng)10d后，再轉(zhuǎn)為全光照培養(yǎng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方式

本試驗(yàn)每個(gè)處理接種20塊葉片，每處理重復(fù)2次；設(shè)置不同的實(shí)驗(yàn)組合，具體實(shí)驗(yàn)方案見(jiàn)文中的結(jié)果與分析。統(tǒng)計(jì)時(shí)間為接種后第30天；實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SAS11.0處理，部分?jǐn)?shù)據(jù)采用Duncans新復(fù)極差法。

1.4 培養(yǎng)基配方

培養(yǎng)基主要成分：基本培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，附加3%蔗糖、5g·L-1 的瓊脂粉。

1.5 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)濕度條件為：65%～70%；24 h全光照或全黑暗處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

為了探究櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最適溫度，我們以櫟葉枇杷的葉片為材料，培養(yǎng)基配方為MS+KT 0.2+BA 0.2+NAA 0.5。設(shè)置3個(gè)不同溫度，每個(gè)處理重復(fù)2次，每個(gè)重復(fù)接種20個(gè)材料。接種后，全黑暗處理10 d后，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1。

在不同的溫度處理下，櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導(dǎo)率有一定的差別。當(dāng)處理溫度為18℃和25℃時(shí)，葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率都約為50%，沒(méi)有什么差別；當(dāng)處理溫度為22℃時(shí)，葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到81.82%。說(shuō)明溫度偏高或偏低都不利于櫟葉枇杷葉片愈傷組織的誘導(dǎo)，只有22℃時(shí)，比較適合葉片愈傷組織的形成。

2.2 黑暗培養(yǎng)對(duì)櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

為研究經(jīng)全黑暗培養(yǎng)和沒(méi)有經(jīng)黑暗培養(yǎng)的處理?xiàng)l件下對(duì)櫟葉枇杷愈傷組織誘導(dǎo)的影響。設(shè)置2組實(shí)驗(yàn)，第1組為材料接種到培養(yǎng)基后，便在每天24h光照下培養(yǎng)30d；第2組為材料接種到培養(yǎng)基后，便每天24h全黑暗下培養(yǎng)10d，再轉(zhuǎn)為每天全光照24h下，再連續(xù)培養(yǎng)20d。以上兩組實(shí)驗(yàn)都設(shè)置如表2的6個(gè)不同的配方組合處理。培養(yǎng)溫度為：22℃。結(jié)果如圖2所示。

由圖1可以看出，除了配方3沒(méi)有誘導(dǎo)出愈傷組織外，其他培養(yǎng)基配方均誘導(dǎo)出葉片愈傷組織；有經(jīng)黑暗培養(yǎng)10 d的第1實(shí)驗(yàn)組，除了配方3，其它配方的愈傷誘導(dǎo)率明顯都高于另外一組沒(méi)經(jīng)黑暗階段的第2組實(shí)驗(yàn)，在有經(jīng)過(guò)黑暗處理的配方上，平均愈傷組織誘導(dǎo)率為57.8%，而實(shí)驗(yàn)組2的平均愈傷誘導(dǎo)率為40%；尤其黑暗處下的MS+KT 0.2 mg·L-1+6-BA 0.2 mg·L-1+2，4-D 1.0mg·L-1配方，誘導(dǎo)率可以達(dá)到100%，啟動(dòng)也相對(duì)較快。與此同時(shí)，在配方MS+BA 1.0這一組處理中，原本在全光照下無(wú)法誘導(dǎo)愈傷組織生長(zhǎng)的配方，而經(jīng)黑暗處理后誘導(dǎo)出了愈傷組織，并取得了40%的誘導(dǎo)率。說(shuō)明黑暗處理對(duì)于枇杷愈傷組織的誘導(dǎo)起到了很大的促進(jìn)作用。

實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在黑暗培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組下的葉片，大部分的處理在接種4d后開(kāi)始膨大，10d后從葉片邊緣和葉脈處出現(xiàn)愈傷組織，30d 時(shí)已長(zhǎng)出大量愈傷組織；而沒(méi)有經(jīng)黑暗培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組在同樣的時(shí)間點(diǎn)確實(shí)沒(méi)有特別明顯的愈傷組織出現(xiàn)。

2.3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由圖1可得，如單獨(dú)使用 6-BA的愈傷組織誘導(dǎo)率為40%；單獨(dú)使用KT處理的誘導(dǎo)率為50%；而單獨(dú)使用2，4-D，不添加任何細(xì)胞分裂素，愈傷誘導(dǎo)率為只為0%。而在添加低濃度6-BA 0.2 mg·L-1和KT 0.2 mg·L-1的基礎(chǔ)上改變2，4-D的濃度，所有處理都要比較單獨(dú)使用一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的的愈傷誘導(dǎo)率要高。

在添加6-BA、KT與2，4-D不同濃度的組合中，發(fā)現(xiàn)隨著2，4-D濃度的升高，愈傷誘導(dǎo)率出現(xiàn)明顯的下降。當(dāng)2，4-D濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率為100%；當(dāng)2，4-D濃度為3.0 mg·L-1時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率降為96.67%；隨著2，4-D濃度升高到6.0 mg·L-1時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率已經(jīng)降為60%?？梢?jiàn)，2，4-D 對(duì)于櫟葉枇杷葉片愈傷組織的誘導(dǎo)形成有重要的促進(jìn)作用，但濃度不宜過(guò)高，也不適合單獨(dú)使用。實(shí)驗(yàn)表明，櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導(dǎo)最適合的培養(yǎng)基配方為MS+KT 0.2 mg·L-1+6-BA 0.2 mg·L-1+2，4-D 1.0 mg·L-1。

3 結(jié)論

環(huán)境的培養(yǎng)因素對(duì)櫟葉枇杷葉片愈傷組織的誘導(dǎo)有較大影響。在本文的3個(gè)溫度設(shè)置試驗(yàn)中，數(shù)據(jù)顯示在溫度22℃時(shí)，是比較適合葉片愈傷組織的誘導(dǎo)。另外，單一使用某一種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)所得的效果并不如多種配合使用，尤其是2，4-D，單獨(dú)使用幾乎沒(méi)有效果，但是配合BA，KT時(shí)則大大提高了櫟葉枇杷葉片愈傷誘導(dǎo)率。通過(guò)對(duì)野生枇杷櫟葉枇杷的葉片愈傷組織誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為在培養(yǎng)溫度22℃下，以MS+BA0.2 mg·L-1+KT0.2 mg·L-1+2，4-D 1.0mg·L-1作為最適培養(yǎng)基，材料接種后黑暗處理10 d，再轉(zhuǎn)為全光照，是櫟葉枇杷葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)條件。通過(guò)本試驗(yàn)，對(duì)野生櫟葉枇杷葉片愈傷組織有了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，從而為探索其它野生種枇杷屬植物的葉片愈傷組織誘導(dǎo)研究提供一些理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)借鑒。

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作者簡(jiǎn)介：劉義存（1979-），男，助理研究員，博士，主要研究方向：園藝植物種質(zhì)資源與生物技術(shù)；黃天啟（1993-），男，在讀研究生，主要研究方向：果樹(shù)生物技術(shù)。