蔣潔　楊玉文　王鐵霖　楊姍姍　趙廷昌

摘 要： 為了解西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli）雙精氨酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（Twin-arginine translocation system，Tat）關(guān)鍵基因tatB的生物信息學(xué)信息，利用相關(guān)軟件對西瓜嗜酸菌和其他7種革蘭氏陰性菌的TatB蛋白進行理化性質(zhì)分析，氨基酸序列分析以及遺傳距離分析；同時對西瓜嗜酸菌TatB蛋白的疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域以及三級結(jié)構(gòu)模型進行了預(yù)測。結(jié)果表明，西瓜嗜酸菌TatB的理化性質(zhì)和洋蔥布克氏菌（Burkholderia cenocepacia）更加接近，水稻白葉枯病菌TatB理化性質(zhì)與其他6種細菌的相差較遠；西瓜嗜酸菌TatB蛋白遺傳關(guān)系與水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae）的最遠，與洋蔥酸皮病菌以及茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）的較為接近；預(yù)測西瓜嗜酸菌TatB蛋白有3個區(qū)域的疏水性比較高，在氨基酸序列的2～18位以及100～106位有2個跨膜區(qū)域，其三級結(jié)構(gòu)可能為“L”型。對西瓜嗜酸菌tatB基因進行基本生物信息學(xué)分析，豐富了其生物信息學(xué)資料，有助于對西瓜嗜酸菌的致病機制進行深入研究，為以后選育抗病品種以及研發(fā)特異性的新藥提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 西瓜嗜酸菌； tatB基因； 生物信息學(xué)分析

Abstract： In order to learn basic knowledge of tatB gene in Acidovorax citrulli，the pathogen for bacterial fruit blotch（BFB），we used the method of bioinformatics to analyze TatB proteins in eight bacteria including A. citrulli. We analyzed physical hydrophobicity，transmembrane domain，tertiary structure in TatB protein of A. citrulli. The results showed that the physical and chemical properties of A. citrulli were more similar to that of Burkholderia cenocepacia. The TatB protein of A. citrulli was closer to that of B. cenocepacia and Ralstonia solanacearum in genetic distances. There were three parts in the TatB protein，a hydrophobic domain and two transmembrane domains. We predicated that the tertiary structure is L-shape. The bioinformatic data of TatB protein and tatB gene can help us to explore the pathogenic mechanism of BFB and to create new fungicides.

Key words： Acidovorax citrulli； tatB gene； Bioinformatic analysis

西瓜嗜酸菌[Acidovorax citrulli （Schaad et al.）]引起的西瓜細菌性果斑病是西甜瓜產(chǎn)業(yè)上的毀滅性病害，給我國的西甜瓜產(chǎn)業(yè)造成了極大的損失[1]。和其他的革蘭氏陰性菌一樣， A. citrulli的致病性與其蛋白分泌系統(tǒng)有緊密聯(lián)系[2]。許多研究都指出植物病原細菌的III型分泌系統(tǒng)與病原菌的致病力有重要聯(lián)系[3]，但是對其他分泌系統(tǒng)與致病能力關(guān)系的報道比較少。雙精氨酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（Twin-arginine translocation，Tat）是革蘭氏陰性菌的兩步分泌系統(tǒng)的重要組成部分[4]。革蘭氏陰性菌的細胞膜由細胞內(nèi)膜，周質(zhì)空間和細胞外膜組成[5]。Tat主要負責將折疊好的蛋白質(zhì)從細菌細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運至周質(zhì)空間，它在II型和V型分泌系統(tǒng)中比較常見[6]。

Tat系統(tǒng)主要由TatA、TatB、TatC和TatE組成，其中TatB和TatC處于核心地位[7]。有報道[8]指出，水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae）中tatB和tatC基因的缺失會導(dǎo)致水稻白葉枯病菌的致病能力的降低。在梨火疫病菌（Erwinia amylovora）[9]和茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）[10]中Tat系統(tǒng)關(guān)鍵基因的缺失亦會導(dǎo)致病菌的致病力下降。

在西瓜嗜酸菌中還沒有關(guān)于Tat系統(tǒng)的相關(guān)研究，本試驗通過生物信息學(xué)分析的方法，對西瓜嗜酸菌的 tatB基因和TatB蛋白的理化性質(zhì)、疏水特性、跨膜區(qū)域以及三級結(jié)構(gòu)進行分析，為進一步研究該基因的相關(guān)功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 數(shù)據(jù)來源 相關(guān)細菌tatB基因的堿基序列和對應(yīng)蛋白的氨基酸序列均來自NCBI（National Center for Biotechnology Information，NCBI）。選擇水稻白葉枯病菌（X. oryzae）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、茄科雷爾氏菌（R. solanacearum）、洋蔥酸皮病菌（Burkholderia cenocepacia）、十字花科假單胞菌（P. brassicacearum）、大腸桿菌（Escherichia coli）和梨火疫病菌（E.amylovora）中的tatB基因進行試驗，這些菌均為革蘭氏陰性，其中大腸桿菌的Tat系統(tǒng)研究比較深入，其余6種細菌與西瓜嗜酸菌一樣均為植物病原細菌。

1.1.2 相關(guān)軟件和在線工具 ProtParam（http；//web. Expasy.org/protpatam/），MEGA 4.0.2，Hmoment，Tmap， TMpred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_ form.html），CDD search，Swiss-Model（http：//www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html），Protein Data Bank，PyMol.

1.2 方法

1.2.1 西瓜嗜酸菌tatB基因和TatB蛋白基本信息

在NCBI上面登錄西瓜嗜酸菌標準菌株AAC00-1的全基因組序列查找到tatB基因，通過閱讀基因注釋了解該基因的基本功能；在Uniprot中找到AAC00-1的TatB蛋白了解該蛋白的基本信息。

1.2.2 分析8種細菌TatB蛋白理化性質(zhì) 在NCBI上面下載8種細菌的TatB蛋白氨基酸序列，利用在線工具ProtParam（http：//web. Expasy.org/protpatam/）分析其理化性質(zhì)的差異。

1.2.3 構(gòu)建8種細菌TatB蛋白質(zhì)的遺傳進化樹

在MEGA 5上對幾種TatB蛋白的氨基酸序列進行比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析進化距離采取NJ鄰位法，自展檢驗，重復(fù)1 000次。

1.2.4 預(yù)測西瓜嗜酸菌TatB蛋白的疏水性 用EMBOSS軟件包里的Hmoment軟件進行疏水性預(yù)測，為進一步預(yù)測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)打下基礎(chǔ)。

1.2.5 預(yù)測西瓜嗜酸菌TatB蛋白的跨膜結(jié)構(gòu) 用TMpred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_

form.html）在線工具和EMBOSS軟件包里面的Tmap軟件對西瓜嗜酸菌（A. citrulli）的TatB蛋白進行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，為預(yù)測其三級結(jié)構(gòu)做好準備。

1.2.6 模擬西瓜嗜酸菌TatB蛋白的三級結(jié)構(gòu) 在NCBI上BLAST目的蛋白的氨基酸序列，了解該蛋白從屬于哪個蛋白家族以及該蛋白家族的核心序列信息。運用NCBI上的在線工具CDD Search 找到該蛋白家族的主要分布情況，以及它們的保守核心序列的三維結(jié)構(gòu)模型。通過Swiss-Model（http：//www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html）往PDB（Protein Date Bank）中輸入目的蛋白序列，最后利用PyMol軟件顯示預(yù)測出的三級結(jié)構(gòu)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜嗜酸菌tatB基因和TatB蛋白基本信息

tatB基因為西瓜嗜酸菌基因組上的1 156 059至1 156 553位堿基，基因序號（Gene ID，GI）為

120 608 714，染色提上的編號為1 054。其CDS區(qū)域由495 bp堿基組成。翻譯出來的TatB蛋白質(zhì)位于細胞內(nèi)膜具有164個氨基酸殘基，是雙精氨酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的重要組分，和TatA以及TatC一起負責轉(zhuǎn)運折疊好的、信號肽上具有雙精氨酸基序的底物蛋白質(zhì)（表1）。

表1 Uniprot中西瓜嗜酸菌TatB蛋白總體注釋

2.2 8種細菌TatB蛋白的理化性質(zhì)

用ProtParam分析8種細菌的TatB蛋白的理化性質(zhì)（表2），發(fā)現(xiàn)除了水稻白葉枯病菌的TatB蛋白的氨基酸殘基組成超過了200個之外，其他7種細菌的TatB的氨基酸殘基數(shù)都在140～190之間。西瓜嗜酸菌、茄科雷爾氏菌及洋蔥酸皮病菌的理論等電點偏堿性且差距不大，其他細菌TatB的偏向酸性且差距較大。8種細菌的TatB蛋白質(zhì)里面丙氨酸所占比重最大，其次所占比重較大的是亮氨酸和精氨酸。等電點偏堿性的TatB蛋白中其堿性氨基酸的比例較酸性氨基酸的大，等電點偏酸性的則相反。8種細菌的TatB蛋白中只有西瓜嗜酸菌和水稻白葉枯病菌的TatB蛋白穩(wěn)定。除了水稻白葉枯病菌的TatB蛋白主要表現(xiàn)為疏水性外，其他細菌的TatB蛋白均為兩性。

2.3 構(gòu)建8種細菌TatB蛋白質(zhì)的遺傳進化樹

比對8種細菌TatB蛋白的氨基酸序列后用MEGA5建立遺傳進化樹，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明西瓜嗜酸菌的TatB蛋白與茄科雷爾氏菌和洋蔥酸皮病菌的為一類，它們的遺傳距離比較近，而兩種假單胞屬的細菌的TatB蛋白質(zhì)在同一個分枝說明它們TatB蛋白的親緣關(guān)系更加接近。而水稻白葉枯病菌的TatB蛋白與其他幾種細菌的遺傳距離最遠，這可能與其蛋白質(zhì)的大小也有關(guān)系，從2.2中的理化性質(zhì)分析中可知水稻白葉枯病菌的TatB蛋白與其他細菌的相差很大。

2.4 預(yù)測西瓜嗜酸菌TatB蛋白的疏水性

用EMBOSS軟件包里的Hmoment軟件對西瓜嗜酸菌的TatB蛋白進行疏水性預(yù)測結(jié)果見圖2。軟件預(yù)測，結(jié)果表明在西瓜嗜酸菌的3個部位的疏水性較強：1～10氨基酸殘基處，90～105氨基酸殘基處以及135氨基酸殘基附近。預(yù)測目的蛋白可能存在2～3個跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域。

2.5 預(yù)測西瓜嗜酸菌TatB蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)

使用在線工具TMpred和EMBOSS軟件包里面的Tmap軟件對西瓜嗜酸菌TatB蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)目的蛋白在2～18位和100～106位氨基酸殘基之間有兩個明顯的跨膜區(qū)域（圖3和圖4）。該結(jié)果與2.4中疏水性預(yù)測的結(jié)果相符。

2.6 模擬西瓜嗜酸菌TatB蛋白的三級結(jié)構(gòu)

通過模擬目的蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)模型，可以更形象地將它的功能和結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來。在NCBI上BLAST目的蛋白序列，發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于mttA/Hcf106 超蛋白家族。該家族的核心區(qū)域三級結(jié)構(gòu)是“L”型（圖5），主要分布在雙精氨酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的蛋白質(zhì)中和真核生物的轉(zhuǎn)移起始因子中。

用SWISS-MODEL在線工具模擬、PyMol軟件得到的目的蛋白的三級結(jié)構(gòu)有3個α螺旋，其主要的三維結(jié)構(gòu)模型有2個（圖6-A、B），但是考慮到其超家族的核心區(qū)域三級結(jié)構(gòu)、TatB蛋白的跨膜分布，以及預(yù)測出來的兩個跨膜結(jié)構(gòu)域，認為圖6（B）中的模型更正確。

3 討 論

TatB蛋白是雙精氨酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中的關(guān)鍵組成部分。同很多的植物病原細菌一樣，西瓜嗜酸菌也具有雙精氨酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，該菌中Tat的主要組成部分和大腸桿菌一樣包括TatA，TatB和TatC三部分。

本研究主要對西瓜嗜酸菌TatB蛋白進行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)西瓜嗜酸菌中tatB基因位于基因組的1 156 059至1 156 553位堿基上，由495 bp核苷酸組成，翻譯產(chǎn)物具有164個氨基酸殘基。TatB分布在細菌細胞內(nèi)膜，起移位酶的作用。它的理化性質(zhì)和洋蔥酸皮病菌以及茄科雷爾氏菌比較相似，而細菌的分類學(xué)上這3種細菌都曾被劃分到假單胞菌屬中，因此從某種程度上來說它們的TatB蛋白的遺傳關(guān)系可能比較接近。但是根據(jù)圖1的進化樹分布，發(fā)現(xiàn)2種假單胞菌屬的細菌跟它們之間相差得還比較遠，這說明由一個蛋白或一個基因來確定進化2個物種的進化關(guān)系是不準確的。水稻白葉枯病菌的TatB蛋白與其他細菌的TatB蛋白相差比較大，所以導(dǎo)致其理化性質(zhì)差異顯著、親緣關(guān)系比較疏遠。

西瓜嗜酸菌TatB蛋白的疏水性預(yù)測、跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測以及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)構(gòu)比較一致，試驗的結(jié)構(gòu)顯示它具有2～3個疏水性較高的部位，2個跨膜結(jié)構(gòu)域。其三級結(jié)構(gòu)與它從屬的超家族mttA/Hcf106核心序列區(qū)域一致，都是“L”型。

目前對大腸桿菌的Tat系統(tǒng)的研究比較深入，但是具體的機制還是不夠明確。而很多研究報道指出Tat蛋白分泌系統(tǒng)關(guān)鍵基因的缺失會降低植物病原細菌的毒力。在已有的報道中，并沒有關(guān)于人和動物的Tat系統(tǒng)[11]。所以對研究西瓜嗜酸菌TatB蛋白進行生物信息學(xué)分析，能夠充實其分子生物學(xué)資料，對于揭示西瓜嗜酸菌的致病機制、發(fā)明新型靶標農(nóng)藥及培育抗性品種有重要意義。

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