劉星++胡金鳳++王希東

摘要：為了解西瓜食酸菌耐藥結(jié)節(jié)細(xì)胞分化（RND）家族外排轉(zhuǎn)運(yùn)體中膜融合蛋白CusB生物信息學(xué)信息，利用相關(guān)軟件對西瓜食酸菌和其他革蘭氏陰性細(xì)菌的CusB蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，同時(shí)對西瓜食酸菌CusB蛋白的疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)、信號肽及分泌蛋白亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果表明：西瓜食酸菌CusB蛋白理化性質(zhì)及進(jìn)化樹分析結(jié)果與大腸桿菌較為接近，梨火疫病菌、熒光假單胞菌與其他5種細(xì)菌遺傳距離較遠(yuǎn)，預(yù)測西瓜食酸菌CusB蛋白有1個(gè)區(qū)域疏水性較高，存在1個(gè)近N端的跨膜結(jié)構(gòu)域，且還有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，前1～36個(gè)氨基酸殘基組成了信號肽，分泌蛋白位于周質(zhì)空間，二級結(jié)構(gòu)含有較多的α-螺旋、無規(guī)則卷曲。對CusB蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，既豐富了信息學(xué)信息，又有助于在其分子水平的研究，同時(shí)也為西瓜食酸菌的抗銅性機(jī)理研究提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：瓜類細(xì)菌性果斑??；西瓜食酸菌；RND外排轉(zhuǎn)運(yùn)體；CusB蛋白；生物信息學(xué)分析

中圖分類號： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0034-04

瓜類細(xì)菌性果斑?。╞acterial fruit bloteh，BFB）是一種嚴(yán)重危害葫蘆科植物的世界性種傳細(xì)菌性病害，其病原菌為西瓜食酸菌（Acidovorax citrulli）[1]。自從1965年在美國首次發(fā)現(xiàn)西瓜食酸菌以來，世界多國已相繼報(bào)道該病害的發(fā)生[2]。目前在我國主要分布于新疆、內(nèi)蒙古、山東、陜西、河北、福建、云南、吉林、海南、黑龍江、遼寧、臺(tái)灣等15個(gè)?。ㄊ校┑奈魈鸸戏N植區(qū)[3]，該病害嚴(yán)重影響了葫蘆科植物的產(chǎn)量和商品銷量，是我國葫蘆科作物產(chǎn)業(yè)的主要危害因子[4]。

由于西瓜食酸菌屬于革蘭氏陰性菌，因此其細(xì)胞質(zhì)膜由細(xì)胞外膜、周質(zhì)空間、細(xì)胞內(nèi)膜構(gòu)成[5]，并且其細(xì)胞膜上存在著革蘭氏陰性細(xì)菌特有的耐藥結(jié)節(jié)細(xì)胞分化（RND）外排轉(zhuǎn)運(yùn)體[6]，該轉(zhuǎn)運(yùn)體由3個(gè)部分構(gòu)成：外膜蛋白（outer membrane protein，OMP）、內(nèi)膜蛋白（inner membrane efflux proteins，IMP）、膜融合蛋白（membrane fusion proteins，MFP），主要負(fù)責(zé)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)重金屬離子、色素分子、糖類、抗生素等由胞內(nèi)向胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)[7]。已有報(bào)道指出，大腸桿菌（Escherichia coli）中編碼CusB蛋白的基因突變會(huì)導(dǎo)致銅離子、銀離子無法正常轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，最終導(dǎo)致大腸桿菌死亡[8]。在銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中RND外排轉(zhuǎn)運(yùn)體任一組分缺失都會(huì)影響外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的正常工作[9]。目前，在西瓜食酸菌中還未見關(guān)于RND外排轉(zhuǎn)運(yùn)體中膜融合蛋白的報(bào)道。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)分析的方法，對A.citrulli的膜融合蛋白基因cusB基因和CusB蛋白的理化性質(zhì)、進(jìn)化分析、疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸化、信號肽、分泌蛋白亞細(xì)胞定位和蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測分析，以期為瓜類細(xì)菌性果斑病菌的抗銅分子機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1數(shù)據(jù)來源本研究所用的西瓜食酸菌膜融合蛋白的氨基酸序列為筆者所在實(shí)驗(yàn)室測序獲得的膜融合蛋白序列，在本試驗(yàn)中命名為CusB。選擇梨火疫病菌（Erwinia amylovory，NC_005246）、茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum，NC_001399）、大腸桿菌（Escherichia coli，NC_007779）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，NC_022361）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens，NC_012674）、地毯草黃單胞菌柑橘致病變種（Xanthomonas axonopodis pv. citri，NC_005240）中編碼膜融合蛋白的基因進(jìn)行研究。

1.1.2相關(guān)軟件和在線工具本研究中所用相關(guān)軟件和在線工具主要有：ClustalX、MEGA 4.0、ProtParam、DNAMAN、

NETPHOBAC（www.cbs.dtu/）、SignalP、TargetP、TatP1.0、PSIPREDv3.0（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/）、SWISS-MODEL。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1cusB基因基本信息登陸NCBI網(wǎng)站，搜索西瓜食酸菌全基因組序列同源的膜融合蛋白基因Aave_4663，了解該基因的基本信息。

1.2.2西瓜食酸菌及其他常見病原菌膜融合蛋白的理化性質(zhì)比較利用分析軟件ProtParam對以上細(xì)菌膜融合蛋白CusB的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。

1.2.3西瓜食酸菌與其他常見病菌膜融合蛋白氨基酸序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建以上述菌株為待測材料，對膜融合蛋白序列進(jìn)行聚類分析，以CusB蛋白為標(biāo)記，進(jìn)行A.citrulli的CusB系統(tǒng)進(jìn)化分析。蛋白質(zhì)序列比對使用Clustal X方法[10]，系統(tǒng)發(fā)育分析使用MEGA4[11]。采用鄰接法，自展 1 000 次以評估樹的可靠性。

1.2.4CusB蛋白疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測利用在線分析軟件ProtScale（www.expasy.org/）對西瓜食酸菌CusB蛋白進(jìn)行疏水性分析；利用TMHMM軟件對西瓜食酸菌CusB蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；利用在線軟件NETPHOBAC（www.cbs.dtu/）分析CusB蛋白磷酸化。

1.2.5CusB序列信號肽預(yù)測及蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位利用SignalP、TargetP預(yù)測西瓜食酸菌CusB序列信號肽與蛋白質(zhì)到達(dá)的亞細(xì)胞位點(diǎn)。

1.2.6CusB蛋白二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測利用在線軟件PSIPREDv3.0（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/）對西瓜食酸菌CusB蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，利用在線軟件SWISS-Model（http：//swissmodel.expasy.org/）對其進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

2結(jié)果與分析

2.1西瓜食酸菌cusB基因的基本信息

測序發(fā)現(xiàn)，西瓜食酸菌cusB基因長度為1 185 bp，編碼394個(gè)氨基酸序列。通過登陸NCBI網(wǎng)站，對西瓜食酸菌Aave_4663基因進(jìn)行查閱發(fā)現(xiàn)：在UniProt中對膜融合蛋白的解釋為轉(zhuǎn)運(yùn)體。其功能包含吖啶黃抗性、重金屬外排和多藥抗性蛋白，大多數(shù)該家族蛋白存在于革蘭氏陰性菌中，其膜融合蛋白使內(nèi)膜蛋白和外膜蛋白結(jié)合在一起，形成一種轉(zhuǎn)運(yùn)通道，使得胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)桨狻?/p>

2.2西瓜食酸菌及其他革蘭氏陰性菌膜融合蛋白的理化性質(zhì)比較

用在線軟件ProtParam（http：//web.expasy.org/）分析包含西瓜食酸菌在內(nèi)的7種病菌膜融合蛋白的氨基酸序列，詳見表1。由該蛋白氨基酸序列可知，分子式為C174 1H290 3N555O556S5，相對分子量為40.666 8 ku，具有394個(gè)氨基酸殘基，含量較多的有丙氨酸（A，20.8%）、纈氨酸（V，9.9%）、亮氨酸（L，8.9%），含量較少的有半胱氨酸（C，0.3%）、色氨酸（W，0.5%）、酪氨酸（Y，0.5%），pI值為10.58，不含有以終止密碼編碼的吡咯賴氨酸（Pyl）、硒半胱氨酸（Sec），半衰期在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞離體培養(yǎng)為30 h，在酵母菌體內(nèi)培養(yǎng)大于20 h，大腸桿菌內(nèi)大于10 h，脂溶系數(shù)90.10，不穩(wěn)定系數(shù)30.16，說明該蛋白穩(wěn)定且耐熱。由表1可知，7種細(xì)菌的膜融合蛋白氨基酸殘基數(shù)在350～400個(gè)之間，其中西瓜食酸菌的膜融合蛋白殘基數(shù)位于第2，與梨火疫病菌、大腸桿菌的膜融合蛋白氨基酸殘基數(shù)較為接近，與地毯草黃單胞菌柑橘致病變種氨基酸殘基數(shù)相差較大。在相對分子量上，西瓜食酸菌排第3，茄科雷爾氏菌、銅綠假單胞菌較為接近，熒光假單胞菌分子量最低。

西瓜食酸菌的膜融合蛋白中酸性氨基酸的數(shù)量少于堿性氨基酸，理論等電點(diǎn)偏堿性，大部分理化性質(zhì)與大腸桿菌相似。西瓜食酸菌不穩(wěn)定系數(shù)較低，說明穩(wěn)定性較好。2.3西瓜食酸菌及其他常見病菌膜融合蛋白氨基酸序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

Clustal X軟件分析蛋白質(zhì)一級序列見圖1。比對7種細(xì)菌CusB蛋白的氨基酸序列后用MEGA 4.0建立進(jìn)化樹，結(jié)果見圖2，可見西瓜食酸菌與大腸桿菌聚類分析結(jié)果落在同一分支上，而與梨火疫病菌、熒光假單胞菌距離較遠(yuǎn)。由此可知：序列比對和進(jìn)化樹構(gòu)建分析證實(shí)了CusB蛋白是1個(gè)RND外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的膜融合蛋白亞基。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)：西瓜食酸菌的CusB蛋白也與銅綠假單胞菌的膜融合蛋白和地毯草黃單胞菌柑橘致病變種及茄科雷爾氏菌屬于同類蛋白質(zhì)。

2.4西瓜食酸菌CusB蛋白疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)最重要的作用力就是疏水相互作用，在天然蛋白質(zhì)中，疏水鍵是疏水側(cè)鏈為了避開水相而群聚在一起的一種相互作用。疏水作用對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、構(gòu)象、功能具有重要意義。利用PROTSCALE軟件對西瓜食酸菌的CusB蛋白進(jìn)行疏水性分析，圖3結(jié)果表明，前30個(gè)氨基酸疏水性比較高。跨膜結(jié)構(gòu)域通常由20個(gè)左右的疏水性氨基酸殘基組成，主要形成α-螺旋。利用TNHMM軟件對西瓜食酸菌CusB蛋白分析表明，該蛋白存在1段從第9至第31個(gè)氨基酸殘基組成的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)，定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，這與疏水性分析結(jié)果一致（圖4）。利用軟件NETPHOSBAC1.0對西瓜食酸菌CusB蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測分析可知：在氨基酸全序列中，共有17個(gè)磷酸化位點(diǎn)。

2.5西瓜食酸菌CusB序列信號肽預(yù)測及蛋白質(zhì)到達(dá)的亞細(xì)胞位點(diǎn)

利用SignalP-NN、SignalP-HMM對西瓜食酸菌CusB序列信號肽進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果表明：西瓜食酸菌CusB序列存在信號肽序列，其大小為1～36 bp；經(jīng)過圖5的TargetP分析可知，信號肽類型為信號肽酶I（SPI），其所分泌的蛋白質(zhì)所到達(dá)的亞細(xì)胞位點(diǎn)為S（即分泌到周質(zhì)空間）。

2.6西瓜食酸菌CusB蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用在線軟件PSIPREDv3.0（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/）對西瓜食酸菌CusB蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，通過不同的算法[蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分類判別預(yù)測（OSC）、多變量線性回歸組合預(yù)測（MLRC）、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測（PHD）、綜合預(yù)測（Sec·Cons）]計(jì)算α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲各自占比得出更確切的參考值。由表2可知，CusB蛋白是α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲同時(shí)存在的一種蛋白，且α-螺旋和無規(guī)則卷曲含量較多。利用Swiss-Model對西瓜食酸菌的cusB基因編碼蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模，結(jié)果表明：CusB蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)元件，α-螺旋集中在一側(cè)，延伸鏈貫穿整條肽鏈（圖6）。

3討論與結(jié)論

RND外排轉(zhuǎn)運(yùn)體是革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜上所特有的一類轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中CusB蛋白是關(guān)鍵組分之一。西瓜食酸菌中的RND外排轉(zhuǎn)運(yùn)體主要成分與大腸桿菌一樣，包括CusA、CusB、CusC 3個(gè)部分。

本研究主要對西瓜食酸菌的CusB蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：西瓜食酸菌cusB基因由1 185 bp核苷酸組成，翻譯產(chǎn)物為394個(gè)氨基酸殘基；CusB蛋白位于周質(zhì)空間內(nèi)，起著連接外膜蛋白和內(nèi)膜蛋白并穩(wěn)定RND外排轉(zhuǎn)運(yùn)體以及運(yùn)輸物質(zhì)的作用。CusB蛋白的理化性質(zhì)與大腸桿菌相似，由進(jìn)化樹分析可知：西瓜食酸菌與大腸桿菌CusB蛋白為同一類蛋白，而梨火疫病菌、熒光假單胞菌與其他細(xì)菌遺傳距離較遠(yuǎn)，同屬假單胞菌屬的銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌在CusB蛋白進(jìn)化上也存在明顯差異，這說明由1個(gè)蛋白或基因來判定二者的進(jìn)化關(guān)系是不精準(zhǔn)的。蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機(jī)制，一般發(fā)生在翻譯后修飾，同時(shí)也是原核生物最重要的調(diào)控修飾之一，由于氨基酸側(cè)鏈加入了1個(gè)帶強(qiáng)負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，發(fā)生酯化作用，從而改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象、活性、與其他分子相互作用的能力，CusB蛋白存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，這可能與膜融合蛋白通過改變自身構(gòu)象來轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬離子并轉(zhuǎn)運(yùn)至外膜蛋白有關(guān)，也可能與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，磷酸化在該蛋白上的具體功能還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

信號肽在蛋白質(zhì)分泌過程中起著重要的作用，一般由 10～60個(gè)氨基酸殘基組成，通過在線軟件分析預(yù)測可知：該蛋白存在1段大小為1～36個(gè)氨基酸殘基組成的信號肽序列，并且信號肽分泌蛋白亞細(xì)胞器分布表明：分泌蛋白的分泌途徑所到達(dá)的位點(diǎn)為S型，即分泌在周質(zhì)空間占88.6%；M型途徑，即定位于線粒體中占43.7%，未確定型占0.3%。S型所占比例較大，這再次體現(xiàn)了Ma在研究茄科雷爾氏菌時(shí)發(fā)現(xiàn)的革蘭氏陰性菌分泌蛋白通常位于周質(zhì)空間和質(zhì)膜外的結(jié)論[12]。西瓜食酸菌CusB蛋白的疏水性預(yù)測與跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果一致，在多肽鏈上近N端存在疏水性較高的部位及相應(yīng)的跨膜結(jié)構(gòu)域。目前，對于大腸桿菌的Cus系統(tǒng)研究比較深入，有報(bào)道指出，cus基因的突變會(huì)降低大腸桿菌對于銅離子、銀離子的外排[13]，因此對西瓜食酸菌的CusB蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)的分析能夠?yàn)榉肿铀降难芯刻峁┮罁?jù)，對于揭示西瓜食酸菌的抗銅機(jī)理以及新型藥物的研發(fā)有重要意義。

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