陳凱麗 孫延鳴++沈文++陳冬梅 +郭海英
摘要:以湖羊SPLUNC1基因?yàn)檠芯繉?duì)象,利用生物信息學(xué)方法對(duì)其編碼的蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜區(qū)域、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、保守區(qū)域分析,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明,湖羊SPLUNC1蛋白的分子量為26.53 ku,理論等電點(diǎn)為5.07。SPLUNC1蛋白N端存在信號(hào)肽,亞細(xì)胞定位在細(xì)胞外。SPLUNC1蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲。該蛋白由4 股反平行的肽段形成的β折疊片和2個(gè)α螺旋組成的桶形結(jié)構(gòu)域組成。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明,湖羊的SPLUNC1蛋白在山羊、牛、豬、人、小鼠中,與山羊首先聚為一類(lèi),后與牛聚為一類(lèi),這與動(dòng)物學(xué)分類(lèi)結(jié)果一致。
關(guān)鍵詞:湖羊;短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1(SPLUNC1);生物信息學(xué)分析
中圖分類(lèi)號(hào): Q781文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A
文章編號(hào):1002-1302(2016)02-0048-03
收稿日期:2015-01-27
基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):31460686)
作者簡(jiǎn)介:陳凱麗(1988—),女,河南南陽(yáng)人,碩士,主要從事動(dòng)物學(xué)研究。E-mail:kellyhenan@163.com。
通信作者:孫延鳴,博士,教授,主要從事臨床獸醫(yī)學(xué)研究。E-mail:sym@shzu.edu.cn。
短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1(short palate,lung and nasal epithelium clone 1,[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ])因其特異表達(dá)于上腭、肺及鼻咽上皮而被命名。Weston等首次克隆了小鼠的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因[1]。SPLUNC1具有分泌物的生化特性[2],分布于細(xì)胞胞漿中[3]。人、小鼠、牛、豬[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]分別定位于20號(hào)染色體、2號(hào)染色體、13號(hào)染色體、17號(hào)染色體。研究表明哺乳類(lèi)動(dòng)物物種擁有共同的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]表達(dá)模式,即在口咽部、上呼吸道、唾液腺和氣管表達(dá),且在革蘭陰性細(xì)菌引起的呼吸道感染中能起到抗菌及抗炎雙重作用[4]。Liu等證明了SPLUNC1是吸道病原菌感染肺部黏膜固有免疫防御相關(guān)決定性成分[5]。Chu等證實(shí)SPLUNC1是一種新的宿主防御肺炎支原體蛋白,體內(nèi)過(guò)表達(dá)的SPLUNC1能顯著地抑制肺部肺炎支原體的載荷量[6]。此外,SPLUNC1在維持上呼吸道穩(wěn)態(tài)方面也起了重要的作用[7]。目前,有關(guān)人和小鼠的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因功能已有相關(guān)報(bào)道,但未見(jiàn)有關(guān)羊的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]相關(guān)功能及其生物信息學(xué)分析的報(bào)道。在此前的研究中,筆者采用RACE技術(shù),從湖羊的肺組織中克隆得到[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ] cDNA序列,并在GenBank上登錄(登錄號(hào):KJ749828.1)。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因序列進(jìn)行分析,為進(jìn)一步研究湖羊SPLUNC1蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件
NCBI(美國(guó)生物技術(shù)研究中心):http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastEXPASY:http://www.us.expasy.ch(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù));MEGA 5.05軟件;RasMol軟件。
1.2湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因cDNA全長(zhǎng)的獲得
從湖羊肺組織中提取RNA,利用RACE技術(shù)分別擴(kuò)增出[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]的3′末端和5′末端序列并送基因公司測(cè)序,用DNAMAN軟件將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接,獲得湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ] cDNA 的全長(zhǎng)序列。湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ] cDNA的全長(zhǎng)序列的具體克隆步驟參照文獻(xiàn)[8]。
1.3生物信息分析方法
利用在線(xiàn)分析工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸理化分析。利用在線(xiàn)分析工具NetNGlyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)對(duì)湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化位點(diǎn)分析。利用在線(xiàn)分析工具WoLF PSORT(http://wolfpsort.org)、TargetP 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)和SignalP-3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)對(duì)湖羊SPLUNC1蛋白在真核細(xì)胞的亞細(xì)胞位置和信號(hào)肽進(jìn)行分析。利用在線(xiàn)分析工具TMPred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)對(duì)湖羊SPLUNC1蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析。利用在線(xiàn)分析工具SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)湖羊SPLUNC1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用NCBI的在線(xiàn)分析工具Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome)對(duì)湖羊SPLUNC1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用在線(xiàn)分析工具3D-PSSM(http//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)和RasMol軟件對(duì)湖羊SPLUNC1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用NCBI 的在線(xiàn)分析工具Blast對(duì)湖羊的SPLUNC1進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。利用MEGA 5.05構(gòu)建湖羊SPLUNC1蛋白的分子進(jìn)化樹(shù)。
2結(jié)果與分析
2.1湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因基本信息與理化性質(zhì)分析
研究利用ExPaSy蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中的ProtParam在線(xiàn)工具對(duì)湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因編碼的蛋白質(zhì)(GenBank登錄號(hào):AIG92771.1)進(jìn)行氨基酸理化性質(zhì)分析,結(jié)果表明,蛋白質(zhì)分子式為C1206H2031N305O348S5,原子總數(shù)為3 895,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為26.53 ku,理論等電點(diǎn)為5.07;不穩(wěn)定系數(shù)為 29.88,說(shuō)明該蛋白為穩(wěn)定蛋白;脂肪系數(shù)為152.08,總平均親水性為0.704,說(shuō)明該蛋白是疏水蛋白。湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因編碼的255個(gè)氨基酸中含量最高的是Leu、Gly 和Val,各有62個(gè)、24個(gè)和24個(gè),分別占24.3%、9.4%和9.4%,且不含有Pyl、 Trp和Sec。利用NetNGlyc 1.0 Server預(yù)測(cè)N-糖基化序列,發(fā)現(xiàn)湖羊的SPLUNC1序列中含有2個(gè)糖基化序列,分別是:NITA和NLTG。由圖1可知,使用亮氨酸拉鏈公式:Leu-X6-Leu-X6-Leu-X6-Leu (X 指代任意氨基酸殘基),在N末端發(fā)現(xiàn)了亮氨酸拉鏈序列。
[FK(W6][TPCKL1.tif][FK)]
2.2湖羊SPLUNC1蛋白的信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位及跨膜區(qū)域分析
結(jié)合Emanuelsson1等和Paul等的亞細(xì)胞定位方法對(duì)湖羊的SPLUNC1進(jìn)行信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位分析[9-10]。使用這2篇文獻(xiàn)中提到的在線(xiàn)分析工具進(jìn)行分析。
WoLF PSORT預(yù)測(cè)運(yùn)用最鄰近結(jié)點(diǎn)算法(k-nearest neighbor algorithm,KNN),K值為32,queryProtein details extr:28,E.R.:3 (extr即extracellular細(xì)胞外的,E.R.即內(nèi)質(zhì)網(wǎng))。點(diǎn)擊網(wǎng)頁(yè)結(jié)果中的”details“查看與湖羊SPLUNC1匹配的32個(gè)蛋白中,有28個(gè)與細(xì)胞外蛋白相似,且評(píng)論大部分為分泌蛋白;有3個(gè)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有關(guān),1個(gè)與溶酶體蛋白相似。
TargetP 1.1 Server結(jié)果表明湖羊SPLUNC1具有分泌途徑,且含有19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。
按照Emanuelsson1等的建議[9],對(duì)TargerP 1.1 Server預(yù)測(cè)的信號(hào)肽使用SignalP-3.0進(jìn)行再次分析,得出的結(jié)果采用neural networks (NN)算法,湖羊SPLUNC1蛋白的信號(hào)肽切割位點(diǎn)為第19個(gè)氨基酸和第20個(gè)氨基酸之間(圖2)。
[FK(W10][TPCKL2.tif][FK)]
利用在線(xiàn)TMPred工具對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè),結(jié)果為:有2個(gè)可能的模型值得考慮,其中一個(gè)模型是N末端在內(nèi)部,有2個(gè)大的跨膜螺旋,分別位于1~21位氨基酸(由內(nèi)到外),47~68位氨基酸(由外到內(nèi)),總分:2 611;另一種模型是有1個(gè)大的跨膜螺旋,位于1~19位氨基酸(由外到內(nèi)),總分:1 260(圖3)。
[FK(W10][TPCKL3.tif][FK)]
綜上所述,湖羊SPLUNC1蛋白含有1個(gè)19位氨基酸的信號(hào)肽,亞細(xì)胞定位于細(xì)胞外,有2個(gè)大的跨膜螺旋。
2.3湖羊SPLUNC1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析
本研究利用SOPMA工具預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示參與形成螺旋(alpha helix)的氨基酸有135個(gè)、占52.94%,參與形成延伸直鏈(extended strand)的氨基酸有38個(gè),占14.90%,參與形成無(wú)規(guī)則卷曲(random coil)的氨基酸有69個(gè),占27.06%。二級(jí)結(jié)構(gòu)分布見(jiàn)圖4。
[FK(W9][TPCKL4.tif][FK)]
2.4湖羊SPLUNC1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析
本研究利用SWISS-MODEL蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)建模工具預(yù)測(cè)湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因編碼蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu),獲得該蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型。使用SWISS-MODEL模板庫(kù)匹配靶序列的進(jìn)化相關(guān)結(jié)構(gòu)進(jìn)行Blast和HHBlits搜索,在匹配的23個(gè)模板里,模板4 kgo.1.A與湖羊SPLUNC1序列的相似最高。使用RasMol軟件查看預(yù)測(cè)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)該蛋白由4 股反平行的肽段形成的β折疊片和2個(gè)α螺旋組成的桶形結(jié)構(gòu)域組成(圖5)。
2.5湖羊SPLUNC1蛋白保守區(qū)域預(yù)測(cè)
利用NCBI的Blast比對(duì)預(yù)測(cè)湖羊SPLUNC1的結(jié)構(gòu)域,由圖6可見(jiàn),湖羊SPLUNC1蛋白有2個(gè)結(jié)構(gòu)域,其中第58個(gè)氨基酸到第233個(gè)氨基酸構(gòu)成的保守結(jié)構(gòu)域與LBP_BPI_CEPT結(jié)[CM(25]構(gòu)域相似,第104個(gè)氨基酸到第231個(gè)氨基酸構(gòu)成的保守[CM)]
[FK(W6][TPCKL5.tif][FK)]
結(jié)構(gòu)域與BPI1結(jié)構(gòu)域相似。
2.6湖羊SPLUNC1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析
使用NCBI 的Blast在線(xiàn)工具對(duì)湖羊SPLUNC1的氨基酸進(jìn)行序列比對(duì),結(jié)果表明,湖羊與山羊、家牛、豬、人、小鼠物種相似性為98%、92%、78%、79%、67%。利用Clustal X 1.81軟件對(duì)6個(gè)物種[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),然后使
[FK(W6][TPCKL6.tif][FK)]
用MEGA 5.05的鄰近法(Neighbor-Joining,NJ)基于該基因氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果構(gòu)建6個(gè)物種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),進(jìn)而反映不同物種的系統(tǒng)進(jìn)化及親緣關(guān)系(由圖7可見(jiàn),分支節(jié)點(diǎn)處數(shù)字為1 000次Bootstrop檢驗(yàn)的支持百分比)。結(jié)果表明,湖羊和山羊的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因同屬一個(gè)分支,親緣關(guān)系比較密切,聚為一類(lèi),隨后這2者與牛聚為一類(lèi),而后與豬聚為一類(lèi),而人和小鼠的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因單獨(dú)為1支。
[FK(W9][TPCKL7.tif][FK)]
3結(jié)論與討論
本研究通過(guò)DNAMAN、NCBI等在線(xiàn)工具和軟件,對(duì)湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因的蛋白結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了分析。由分析結(jié)果可知,克隆的湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因cDNA全長(zhǎng)(GenBank登錄號(hào):KJ749828.1)為1 091 bp,含1個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框(ORF)768 bp,共編碼255個(gè)氨基酸。將湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]基因翻譯的氨基酸序列與已發(fā)表文章小鼠和豬[1,11]SPLUNC1的信息進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)湖羊的SPLUNC1與小鼠在N端都有亮氨酸拉鏈,且排列的位置相同。小鼠的為MFLVGSLVVLCGLLAHSTAQLAGLPLPL,湖羊的為MFQIGSLIVLCGLLAQTTALLEALPVPL,豬的N端未發(fā)現(xiàn),表明亮氨酸拉鏈在物種進(jìn)化上存在差異。另外小鼠的糖基化序列是NPTD、NITA和NLTG,湖羊是NITA和NLTG,豬只有1個(gè)糖基化序列NITV。同時(shí),在小鼠的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]序列上發(fā)現(xiàn)的PLPL結(jié)構(gòu)域以及保守結(jié)構(gòu)域蛋白激酶C(SLK)和酪蛋白激酶Ⅱ(SFVD和SGLD)在湖羊[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]上沒(méi)有被發(fā)現(xiàn),而豬的[WTBX][STBX]SPLUNC1[WTBZ][STBZ]序列上卻發(fā)現(xiàn)有蛋白激酶C(SLK)序列。
最早先采用的是信號(hào)肽預(yù)測(cè)軟件SignalP 4.0分析湖羊SPLUNC1蛋白,發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽切割位點(diǎn)在23~24,而報(bào)道的小鼠和豬的信號(hào)肽切割位點(diǎn)在19~20之間,人的SPLUNC1 蛋白的N 端的信號(hào)肽長(zhǎng)度為19個(gè)氨基酸[12],但是結(jié)合了亞細(xì)胞定位后,支持了信號(hào)肽切割位點(diǎn)為19~20。在亞細(xì)胞定位時(shí)參考了孫偉等和杜慕云等的亞細(xì)胞定位方法[13-14],對(duì)序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),用Signal 3.0分析有2個(gè)結(jié)果,neural networks (NN)的分析結(jié)果為信號(hào)肽切割位點(diǎn)為 19~20,hidden Markov models (HMM)的分析結(jié)果為信號(hào)肽切割位點(diǎn)為23~24。綜合比較后,判斷湖羊SPLUNC1的信號(hào)肽切割位點(diǎn)應(yīng)為 19~20之間,但是仍需試驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。
從近些年的研究報(bào)道中,可以看出大部分的SPLUNC1生物學(xué)研究功能主要在人和鼠上,鮮見(jiàn)羊SPLUNC1生物學(xué)功能的相關(guān)報(bào)道。此次研究運(yùn)用生物信息學(xué)的方法對(duì)湖羊SPLUNC1蛋白的基本理化性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜區(qū)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析,初步預(yù)測(cè)了湖羊SPLUNC1蛋白所擁有的部分特性,以期為深入探討其生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。
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